1. Zaznajte absorbanco raztopine RNA
Absorbanca pri 280, 320, 230 in 260 nm predstavlja vrednosti nukleinske kisline, ozadja (motnost raztopine), koncentracije soli oziroma organske snovi, kot so beljakovine.Na splošno si oglejte samo OD260/OD280 (razmerje, R).Ko je 1,8~2,0, menimo, da je kontaminacija beljakovin ali drugih organskih snovi v RNA sprejemljiva, vendar je treba opozoriti, da je lahko vrednost R, ko se Tris uporablja kot pufer za zaznavanje absorbance, večja od 2 (na splošno mora biti <2,2).Ko je R<1,8, je onesnaženje z beljakovinami ali drugimi organskimi snovmi v raztopini bolj očitno in usoda RNA se lahko določi glede na potrebe.Ko je R>2,2, to pomeni, da je bila RNA hidrolizirana v eno samo nukleinsko kislino.
2.Elektroforetski vzorec RNA
Na splošno se za elektroforezo RNK uporablja denaturacijski gel, če pa gre samo za ugotavljanje kakovosti RNK, denaturacijski gel ni potreben, lahko pa uporabimo navaden agarozni gel.Namen elektroforeze je zaznati celovitost pasov 28S in 18S in njuno razmerje oziroma celovitost razmaza mRNA.Na splošno, če sta pasova 28S in 18S svetla, jasna in ostra (kar se nanaša na robove pasov, so jasni) in je svetlost 28S več kot dvakrat večja od svetlosti pasu 18S, menimo, da je kakovost RNA dobra.
Zgoraj sta dve metodi, ki ju običajno uporabljamo, vendar nam nobena od teh dveh metod ne more jasno povedati, ali je v raztopini RNA preostala RNaza.Če je v raztopini zelo majhna količina RNaze, jo z zgornjo metodo težko zaznamo, vendar večina nadaljnjih encimskih reakcij poteka pri nad 37 stopinjah in dolgo časa.Na ta način, če je v raztopini RNA zelo majhna količina RNaze, bosta tam zelo primerno okolje in čas, da odigrata svojo vlogo v naslednjih poskusih, in seveda bo poskus v tem času hladen.Spodaj predstavljamo metodo, ki lahko potrdi, ali je v raztopini RNA preostala RNaza.
3. Preskus ohranjanja toplote
Glede na koncentracijo vzorca odvzemite dva 1000 ng RNA iz raztopine RNA in ju dodajte v 0,5 ml centrifugalno epruveto ter jo dopolnite s pufrom Tris pH 7,0 do skupne prostornine 10 ul, nato pa zaprite pokrov epruvete.Enega od njih damo v vodno kopel s konstantno temperaturo 70°C in pustimo na toplem 1 uro.Drugi del smo 1 uro shranili v hladilniku pri -20 °C.Ko se čas izteče, odstranite dva vzorca za elektroforezo.Po končani elektroforezi primerjajte elektroforetska trakova obeh.Če sta pasova obeh konsistentna ali se ne razlikujeta bistveno (seveda njuna trakova izpolnjujeta tudi pogoje v 2. metodi), to pomeni, da v raztopini RNK ni preostale kontaminacije z RNazo in je kakovost RNK zelo dobra.Nasprotno, če vzorec, inkubiran pri 70 °C, kaže očitno razgradnjo, to pomeni, da je v raztopini RNK kontaminacija z RNazo.
2 Eksperimentalne metode in tehnike za ekstrakcijo RNA
Težave, na katere pogosto naletimo pri ekstrakciji RNA, so: (1) izkoristek RNA je nizek;(2) RNA ima resno onesnaženje s soljo;(3) RNA ima resno onesnaženje z organskimi topili;(4) degradacija vzorca in druge težave
1. Običajno uporabljeni reagenti za ekstrakcijo celotne RNK
Metoda z gvanidin izotiocianatom in metoda Trizol sta najpogosteje uporabljeni metodi za ekstrakcijo celotne RNK iz živalskih tkiv in živalskih celic.Posebej primeren je za majhne vzorce in tkiva, ki jih je posebej težko ekstrahirati, kot je ekstrakcija celotne RNK iz kunčje kože in živalskega vezivnega tkiva;Poleg tega se lahko Trizol kot univerzalni reagent za lizo uporablja tudi za ekstrakcijo rastlinskih tkiv, bakterij, gliv in drugih tkiv.Za rastlinska tkiva, ki vsebujejo polisaharide in polifenole, kot so kamelija oleifera, čajni listi, oljna ogrščica itd., se lahko metoda CTAB uporabi tudi za ekstrakcijo celotne RNK.
Metoda z dvojno kolono je kot običajna metoda prav tako zelo priljubljena zaradi normalnega temperaturnega delovanja, ni potrebe po dodajanju RNaze in varnosti – brez kloroforma, fenolov in drugih organskih reagentov za ekstrakcijo.(priporočeni izdelki )
2. Ekstrakcija celotne RNA iz živalskih tkiv
(1) Poskusite izbrati sveže tkivo, če ni sveže (po možnosti v treh mesecih – v hladilniku 80 ℃ ali zamrznjeno v tekočem dušiku. Ko režete tkiva, ne režite neposredno pri sobni temperaturi, poskrbite, da ga položite na posodo za led, poskusite se izogniti ponavljajočemu se zamrzovanju in odmrzovanju.
(2) S čistimi škarjami in pinceto izrežite majhen kos tkiva, pri rezanju vzorca poskusite odrezati osrednji del tkiva ali najprej odrežite velik kos tkiva od sredine in nato vzorec odrežite na mestu svežega reza.Odstranjeno tkivo je treba popolnoma razrezati, razrezano tkivo vstaviti v EP epruveto brez RNaze, dodati lizat, razrezano tkivo mora biti popolnoma izpostavljeno lizatu in pripraviti za homogenizacijo.
(3) Za normalna tkiva izberite tkiva v velikosti mung fižola (30–60 mg) za homogenizacijo.Če tkiva vsebujejo veliko količino beljakovin, maščob ali gostih vlaknatih tkiv, kot so jetra, ustrezno povečajte ali zmanjšajte količino razrezanih tkiv (neobvezno) Izberite 10~20 mg).
(4) Če se ekstrahirajo ribje mišice, meso kozic, meduze in druga tkiva z visoko vsebnostjo vode, je treba količino vzorca ustrezno povečati (priporočeno 100–200 mg).
(5) Če razmere dopuščajo, se živalsko tkivo lahko neposredno ekstrahira po homogenizaciji z visokoprepustnim homogenizatorjem tkiva, če take opreme ni.
(6) RNA, pridobljeno po končni ekstrakciji, je treba takoj dati v posodo za led, da se zmanjša razgradnja RNA.
3. Ekstrakcija RNA živalskih celic
(1) Suspenzijske celice: neposredno centrifugirajte in zavrzite medij, 1-2-krat sperite s sterilnim PBS, nato suspendirajte z ustrezno količino PBS in dodajte lizat za lizo.Ne dodajajte lizata neposredno oborjenim celicam, potem ko ste popolnoma zavrgli tekočino.To bo povzročilo, da se histonski paket, ki se sprosti po liziranih celicah na zunanji plasti, prilepi na zunanjost oborjenih celic in s tem omeji stik celic znotraj pelete z lizatom., kar povzroči nepopolno celično lizo in zmanjšan donos RNA.
(2) Celice, ki so pol sprijete ali niso tesno sprijete: Ko zavržete medij, 1-2 krat sperite s PBS, nato neposredno absorbirajte ustrezno količino PBS in posodo s kulturo prepihajte s pipeto ali pištolo, da odpihnete celice in jih prenesete v celice brez RNA.Dodajte lizat v EP epruveto encima za ekstrakcijo.
(3) Sprijete celice: najprej jih je treba prebaviti s tripsinom, nato jih zbrati v epruvete EP brez RNaze, centrifugirati, da odstranimo supernatant, 1-2-krat sprati s PBS, da odstranimo presežek tripsina, in resuspendirati z ustrezno količino PBS. Nato nadaljujte s korakom ekstrakcije.
4. Ekstrakcija rastlinske RNA
Rastlinska tkiva so bogata s fenolnimi spojinami ali bogata s polisaharidi ali vsebujejo nekatere neidentificirane sekundarne metabolite ali imajo visoko aktivnost RNaze.Te snovi so po celični lizi tesno povezane z RNA in tvorijo netopne komplekse ali koloidne oborine, ki jih je težko odstraniti.Zato moramo, ko ekstrahiramo rastlinsko tkivo, izbrati komplet za rastline.Lizat v kompletu lahko učinkovito reši probleme enostavne oksidacije polifenolov in ločevanja polisaharidnih spojin in nukleinskih kislin.
(Za ekstrakcijo polisaharid polifenol rastlinske RNA, priporočeni izdelki:
(1) Lupino, pulpo, semena, liste itd. rastline je treba popolnoma zmleti v možnarju.Med postopkom mletja je treba tekoči dušik pravočasno dopolniti, da preprečimo taljenje vzorca.Zmleti vzorec je treba hitro dodati lizatu in pretresti, da preprečite razgradnjo RNK.
(2) Za vzorce, bogate z vlakninami, kot so riževi in pšenični listi, je treba količino ekstrakcije ustrezno zmanjšati, sicer mletje in liza tkiva ne bosta popolni, kar bo povzročilo nizek izkoristek ekstrahirane RNA.
(3) Za rastlinska tkiva z visoko vsebnostjo vode, kot so sadje granatnega jabolka, sadje lubenice, sadje breskve itd., je treba velikost vzorca ustrezno povečati (100–200 mg ni obvezno).
(4) Za rastlinska tkiva, kot so listi rastlin, korenike, trdo sadje in drugi materiali, se na splošno priporoča uporaba tekočega dušika za temeljito malto sestavin v možnarju in nato nadaljujte s korakom ekstrakcije.Običajni homogenizatorji tkiv morda ne bodo učinkoviti pri homogenizaciji rastlinskih tkiv in jih na splošno ne priporočamo.
5. Varnostni ukrepi za ekstrakcijo RNK
(1) Vzorci tkiv morajo biti čim bolj sveži, da se prepreči ponavljajoče se zamrzovanje in odmrzovanje.
(2) Tkivo mora biti med ekstrakcijo popolnoma zmleto, količina tkiva pa ne sme biti premajhna, kaj šele prevelika.
(3) Po dodajanju lizata je treba dati dovolj časa inkubacije, da se vzorec popolnoma lizira.
(4) Pri uporabi metode Trizol za ekstrakcijo je načelo absorpcije supernatanta po stratifikaciji "raje vdihni manj kot vdihni več" in ne sme ekstrahirati v srednjo plast, sicer bo povzročilo resno kontaminacijo genomske DNA.
(5) Pri pranju se mora čistilna tekočina v celoti infiltrirati okoli stene cevi, da se zagotovi temeljito pranje.
(6) Pri metodi ekstrakcije kolone je treba poleg odstranitve kolone po pranju tudi adsorpcijsko kolono postaviti v ultra čisto mizo in jo pihati 5–10 minut, da organsko topilo popolnoma izhlapi do suhega.
(7) Pri zadnjem eluiranju kolonske metode je treba po dodajanju vode DEPC inkubirati 3–5 minut ali pa je treba vodo DEPC vnaprej segreti na 60 °C, da se poveča izkoristek elucije.Pri tradicionalni metodi cepitve Trizol in obarjanja z izopropanolom se končna RNA raztopi v DEPC vodi, zato je treba dati ustrezen čas za raztapljanje in dno centrifugalne epruvete nenehno pihati s konico pipete.
3 Three Vzroki in rešitve za nizko koncentracijo RNA/slabo kakovost
1. Donos je prenizek
Ekstrahiranega vzorca je premalo, skupna količina je nezadostna ali pa je ekstrahiranega vzorca preveč in liza ni popolna;za ekstrakcijo je treba uporabiti tkivo ali celice ustrezne kakovosti, predobdelava vzorca mora biti dobro opravljena, liza pa mora biti zadostna.
2. Ostanki genoma
Pri ekstrakciji z metodo Trizol, ko se supernatant posesa v srednjo plast po plastenju, bo prišlo do resne kontaminacije genoma;pri plastenju je potrebna posebna previdnost, da se izognete sesanju v srednjo plast.Če se za ekstrakcijo uporablja kolonska metoda, se lahko za ekstrakcijo izbere komplet, ki vsebuje DNazo I.Nukleinska kislina, adsorbirana na membrani, se neposredno razgradi z DNazo I, kar lahko močno zmanjša ostanke DNA.
3. Razgradnja RNA
Lahko gre za razgradnjo samega ekstrahiranega vzorca ali za razgradnjo, povzročeno med postopkom ekstrakcije;kolikor je mogoče, je treba za ekstrakcijo RNK uporabiti sveže vzorce, zbrane vzorce pa pravočasno shraniti v hladilniku s tekočim dušikom ali -80 °C, izogibati pa se je treba ponavljajočemu se zamrzovanju in odmrzovanju.V postopku ekstrakcije RNK je treba uporabiti konice brez RNaze/DNase, centrifugalne epruvete in druge materiale.Postopek ekstrakcije mora biti čim hitrejši.Ekstrahirano RNA je treba dati v škatlo za led in shraniti pri -80.Če je treba ekstrahirano RNA zaznati z gelsko elektroforezo, je treba elektroforezo izvesti takoj po ekstrakciji, pufer za elektroforezo pa zamenjati z novo pripravljenim.
4. Ostanki soli in organskih topil
Ekstrakcijski reagenti vsebujejo fenolne in gvanidinske soli, pralna raztopina pa vsebuje etanol.Med postopkom ekstrakcije lizat ni bil popolnoma absorbiran in zavržen, raztopina za pranje pa ni bila popolnoma posušena.Ostanki soli in organska topila so škodljivi za naknadno reverzno transkripcijo in PCR.Različne stopnje inhibicije, zato mora biti tkivni lizat med postopkom ekstrakcije popolnoma odstranjen, pranje pa mora biti zadostno, da se lahko opere okoliške stene epruvete.Poleg tega je potrebno izprazniti cev in prepihati, kar bo še dodatno zmanjšalo ostanke organske snovi.
Za več informacij o ekstrakciji RNA sledite naši spletni strani:
www.foreivd.com za več informacij.
Čas objave: 1. december 2022
