Nekaj revolucionarnih izumov v zgodovini tehnologije odkrivanja po mojem mnenju je tehnologija imunskega označevanja, ki temelji na načelu specifične vezave antigen-protitelo, tehnologija PCR in tehnologija sekvenciranja.Danes bomo govorili o tehnologiji PCR.Glede na razvoj tehnologije PCR ljudje običajno delimo tehnologijo PCR na tri generacije: navadno tehnologijo PCR, tehnologijo fluorescentne kvantitativne PCR v realnem času in tehnologijo digitalne PCR.
Cobičajna tehnika PCR
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis je leta 1983 izumil verižno reakcijo s polimerazo (verižna reakcija s polimerazo, PCR). Rečeno je, da je, ko je vozil svojo punco, nenadoma dobil navdih in pomislil na načelo PCR (o prednostih vožnje).Kary Mullis je prejel Nobelovo nagrado za kemijo leta 1993. New York Times je komentiral: "Zelo izvirno in pomembno, skorajda deli biologijo na obdobja pred in po PCR.
Načelo PCR: Pod katalizo DNA polimeraze se DNK matične verige uporabi kot predloga, specifični primer pa se uporabi kot izhodišče za podaljšanje, DNK hčerinske verige, ki je komplementarna DNK predloge matične verige, se kopira in vitro z denaturacijo, žarjenjem, podaljšanjem in drugimi koraki.To je tehnologija pomnoževanja sinteze DNK in vitro, ki lahko hitro in specifično pomnoži katero koli ciljno DNK in vitro.
Prednosti navadnega PCR
1.Klasična metoda, popolni mednarodni in domači standardi
2.Nižji stroški reagentov za instrumente
3.Produkte PCR je mogoče obnoviti za druge poskuse molekularne biologije
Priporočen aparat Foregene PCR: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Sorodni izdelki: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Slabosti navadnega PCR
1.enostaven za onesnaženje
2.okorno delovanje
3.le kvalitativna analiza
4.Zmerna občutljivost
5.Obstaja nespecifično ojačanje in ko je nespecifični pas enake velikosti kot ciljni pas, ga ni mogoče razlikovati
CPCR na osnovi apilarne elektroforeze
Kot odgovor na pomanjkljivosti običajne PCR so nekateri proizvajalci predstavili instrumente, ki temeljijo na principu kapilarne elektroforeze.Korak elektroforeze po pomnoževanju PCR je končan v kapilari.Občutljivost je višja, MAERKER pa lahko razloči razliko več baz in izračuna ojačitev.vsebino izdelka.Pomanjkljivost je, da je treba izdelek PCR še vedno odpreti in vstaviti v instrument, še vedno pa obstaja velika nevarnost kontaminacije.
CapilarniEelektroforeza
2. Tehnologija fluorescentne kvantitativne PCR v realnem času (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluorescentna kvantitativna PCR, imenovana tudi PCR v realnem času, je nova kvantitativna tehnologija nukleinske kisline, ki jo je leta 1995 razvil PE (Perkin Elmer). Zgodovina razvoja fluorescentne kvantitativne PCR je zgodovina osupljivih bojev velikanov, kot so ABI, Roche in Bio-Rad.Če vas zanima, si lahko ogledate.Ta tehnika je trenutno najbolj zrela in široko uporabljena polkvantitativna tehnika PCR.
Priporočena naprava qPCR: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Metoda fluorescentnega barvanja (SYBR Green I):SYBR Green I je najpogosteje uporabljeno DNA vezavno barvilo za kvantitativno PCR, ki se nespecifično veže na dvoverižno DNA.V prostem stanju SYBR Green oddaja šibko fluorescenco, ko pa je vezan na dvoverižno DNA, se njegova fluorescenca poveča za 1000-krat.Zato je skupni fluorescentni signal, ki ga oddaja reakcija, sorazmeren s količino prisotne dvoverižne DNA in se bo povečal s povečanjem pomnoženega produkta.Ker se barvilo nespecifično veže na dvoverižno DNA, lahko pride do lažno pozitivnih rezultatov.
Sorodni izdelki: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Metoda fluorescenčne sonde (tehnologija Taqman): MedPomnoževanje PCR, specifična fluorescentna sonda je dodana hkrati s parom primerjev.Sonda je linearen oligonukleotid s fluorescenčno reportersko skupino in fluorescentno dušilno skupino, označeno na obeh koncih.Ko je sonda nedotaknjena, fluorescenčni signal, ki ga oddaja reporterska skupina, absorbira dušilna skupina in zaznavanje Ni fluorescenčnega signala;med pomnoževanjem PCR (v fazi podaljšanja) bo 5'-3' Dicer aktivnost encima Taq prebavila in razgradila sondo, tako da sta reporterska fluorescenčna skupina in dušilna fluorescenčna skupina ločeni, tako da je sistem za spremljanje fluorescence mogoče prejeti, kar pomeni, da vsakič, ko se veriga DNA pomnoži, nastane fluorescentna molekula, ki uresniči popolno sinhronizacijo kopičenja fluorescentnih signalov in nastajanja produktov PCR.Taqmanova metoda sonde je najpogosteje uporabljena metoda odkrivanja v kliničnem odkrivanju.
Sorodni izdelki: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Prednosti qPCR
1.Metoda je zrela, podporna oprema in reagenti pa popolni
2.Srednji stroški reagentov
3.enostaven za uporabo
4.Visoka občutljivost in specifičnost zaznavanja
Slabosti qPCR
Mutacija ciljnega gena povzroči zgrešeno odkrivanje.
Rezultata zaznavanja šablone z nizko koncentracijo ni mogoče določiti.
Pri uporabi standardne krivulje za kvantitativno detekcijo obstaja velika napaka.
3. Digitalna PCR (digitalna PCR, dPCR) tehnologija
Digitalni PCR je tehnika za absolutno kvantifikacijo molekul nukleinskih kislin.V primerjavi s qPCR lahko digitalni PCR neposredno prebere število molekul DNA/RNA, kar je absolutna kvantifikacija molekul nukleinske kisline v začetnem vzorcu.Leta 1999 sta Bert Vogelstein in Kenneth W. Kin-zler uradno predlagala koncept dPCR.
Leta 2006 je bil Fluidigm prvi, ki je izdelal komercialni dPCR instrument na osnovi čipov.Leta 2009 je Life Technologies lansiral sistema OpenArray in QuantStudio 12K Flex dPCR.Leta 2013 je Life Technologies lansiral sistem QuantStudio 3DdPCR, ki uporablja tehnologijo mikrofluidnih čipov visoke gostote za enakomerno porazdelitev vzorcev v 20.000 posameznih celic.v reakcijskem vodnjaku.
Leta 2011 je Bio-Rad lansiral instrument QX100 dPCR na osnovi kapljic, ki uporablja tehnologijo vode v olju za enakomerno porazdelitev vzorca na 20.000 kapljic vode v olju in uporablja analizator kapljic za analizo kapljic.Leta 2012 je RainDance lansiral instrument RainDrop dPCR, ki ga poganja visokotlačni plin, da razdeli vsak standardni reakcijski sistem v reakcijsko emulzijo, ki vsebuje od 1 do 10 milijonov mikrokapljic na ravni pikolitra.
Doslej je digitalni PCR oblikoval dve glavni frakciji, tip čipa in tip kapljice.Ne glede na vrsto digitalnega PCR so njegova temeljna načela omejevanje redčenja, PCR končne točke in Poissonova porazdelitev.Standardni reakcijski sistem PCR, ki vsebuje šablone nukleinske kisline, je enakomerno razdeljen na več deset tisoč PCR reakcij, ki so porazdeljene na čipe ali mikrokapljice, tako da vsaka reakcija vsebuje čim več šablonske molekule, izvede pa se enomolekulska šablonska PCR reakcija.Z odčitavanjem fluorescence se šteje prisotnost ali odsotnost signala, absolutna kvantifikacija pa se izvede po kalibraciji statistične Poissonove porazdelitve.
Sledijo značilnosti več digitalnih platform PCR, ki sem jih uporabil:
1. Kapljični digitalni PCR Bio-Rad QX200 Bio-RadQX200 je zelo klasična digitalna PCR platforma, osnovni postopek zaznavanja: 20.000 vzorcev ustvari generator kapljic. Mikrokapljice vode v olju se pomnožijo na navadnem PCR stroju, končno pa fluorescenčni signal vsake mikrokapljice prebere čitalnik mikrokapljic.Operacija je bolj zapletena, tveganje za onesnaženje pa srednje.
Xinyi TD1 mikrokapljični digitalni PCRXinyi TD1 je domača digitalna platforma PCR, osnovni postopek zaznavanja: ustvarite 30.000–50.000 kapljic vode v olju prek generatorja kapljic, pomnožite na običajnem instrumentu PCR in na koncu prenesite. Čitalnik kapljic prebere fluorescentni signal vsake kapljice.Generiranje kapljic in branje v tej platformi se izvajata v namenskem čipu z nizkim tveganjem kontaminacije.
Digitalni PCR z mikrokapljičnim čipom STILLA NaicaSTILLA Naica je relativno nova digitalna PCR platforma.Osnovni postopek detekcije je: dodajte reakcijsko raztopino v čip, vstavite čip v sistem za ustvarjanje in ojačanje mikrokapljic in ustvarite 30.000 mikrokapljic.Razširite po čipu in pomnoževanje PCR je na čipu končano.Nato se ojačani čip prenese v sistem za analizo odčitavanja mikrokapljic in fluorescentni signal se prebere s fotografiranjem.Ker celoten proces poteka v zaprtem čipu, je tveganje kontaminacije majhno.
4. Digitalni PCR s čipom ThermoFisher QuantStudio 3D
ThermoFisher QuantStudio 3D je še ena klasična digitalna PCR platforma na osnovi čipov.Njegov osnovni postopek odkrivanja je: dodajte reakcijsko raztopino v trosilnik in reakcijsko raztopino enakomerno porazdelite po čipu z 20.000 mikrovdolbinicami skozi trosilnik., položite čip na napravo za PCR, da se ojača, in na koncu vstavite čip v čitalnik in posnemite fotografijo, da preberete fluorescentni signal.Operacija je razmeroma zapletena, celoten postopek pa se izvaja v zaprtem čipu, tveganje kontaminacije pa je majhno.
5. Digitalni PCR s čipom JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity je razmeroma nova digitalna PCR platforma s čipom.Njegov osnovni postopek odkrivanja je: dodajte reakcijsko raztopino v aplikator in skozi aplikator enakomerno razporedite reakcijsko raztopino na 10.000 PCR epruvet, pritrjenih v PCR epruveto.Na mikroporoznem čipu reakcijska raztopina vstopi v čip s kapilarnim delovanjem, epruveta PCR s čipom se postavi na napravo za PCR za pomnoževanje, na koncu pa se čip vstavi v čitalnik, da prebere fluorescentni signal s fotografiranjem.Operacija je bolj zapletena.Tveganje kontaminacije je majhno.
Parametri vsake digitalne platforme PCR so povzeti, kot sledi:
Indikatorji vrednotenja digitalne PCR platforme so: število razdeljenih enot, število fluorescenčnih kanalčkov, kompleksnost delovanja in tveganje kontaminacije.Najpomembnejša stvar pa je natančnost zaznavanja.Eden od načinov za ocenjevanje digitalnih platform PCR je uporaba več digitalnih platform PCR za medsebojno preverjanje, drugi način pa je uporaba standardnih snovi s točnimi vrednostmi.
Prednosti dPCR
1.Doseganje absolutne kvantifikacije
2.Večja občutljivost in specifičnost
3.Lahko zazna majhne kopije vzorcev
Slabosti dPCR1. Draga oprema in reagenti 2. Zapleteno delovanje in dolg čas odkrivanja 3. Ozko območje odkrivanja
Trenutno imajo tri generacije tehnologije PCR svoje prednosti in slabosti in vsaka ima svoja področja uporabe in ni razmerje, da bi ena generacija zamenjala drugo.Nenehni napredek tehnologije je tehnologiji PCR vnesel novo vitalnost, ki ji omogoča odklepanje ene smeri uporabe za drugo, zaradi česar je odkrivanje nukleinske kisline bolj priročno in natančno.
Vir: Dr. Yuan vas pelje na testiranje
Priporočeni izdelki:
Čas objave: 18. nov. 2022
