Izhodiščni material: RNA
Kvantitativna reverzna transkripcija PCR (RT-qPCR) je eksperimentalna metoda, ki se uporablja v poskusih PCR z uporabo RNA kot izhodiščnega materiala.Pri tej metodi se celotna RNA ali messenger RNA (mRNA) najprej prepiše v komplementarno DNA (cDNA) z reverzno transkriptazo.Nato je bila izvedena reakcija qPCR z uporabo cDNA kot predloge.RT-qPCR je bil uporabljen v različnih aplikacijah molekularne biologije, vključno z analizo izražanja genov, validacijo motenj RNA, validacijo mikromrež, odkrivanjem patogenov, genetskim testiranjem in raziskavami bolezni.
Enostopenjske in dvostopenjske metode za RT-qPCR
RT-qPCR se lahko izvede z enostopenjsko ali dvostopenjsko metodo.Enostopenjski RT-qPCR združuje reverzno transkripcijo in pomnoževanje PCR, kar omogoča, da reverzna transkriptaza in DNA polimeraza zaključita reakcijo v isti epruveti pod enakimi pogoji pufra.Enostopenjski RT-qPCR zahteva samo uporabo primerjev, specifičnih za zaporedje.V dvostopenjskem RT-qPCR se reverzna transkripcija in pomnoževanje PCR izvajata v dveh epruvetah z uporabo različnih optimiziranih pufrov, reakcijskih pogojev in strategij zasnove primerja.
Prednost | Slabost | |
En korak | Ta metoda ima manjšo eksperimentalno napako, saj obe reakciji potekata v eni epruveti
Manj korakov pipetiranja zmanjša tveganje kontaminacije
Primerno za visokozmogljivo ojačanje/pregledovanje, hitro in ponovljivo | Dvostopenjskih reakcij ni mogoče optimizirati ločeno
Ker so reakcijski pogoji ogroženi s kombiniranjem dvostopenjske reakcije, občutljivost ni tako dobra kot pri dvostopenjski metodi
Število tarč, ki jih odkrije en vzorec, je majhno |
Dva koraka | Sposobnost ustvarjanja stabilnih knjižnic cDNA, ki jih je mogoče shraniti za daljša obdobja in uporabiti v več reakcijah
Ciljne gene in referenčne gene je mogoče pomnožiti iz iste knjižnice cDNA brez potrebe po več knjižnicah cDNA
Reakcijski pufri in reakcijski pogoji, ki omogočajo optimizacijo potekov posamezne reakcije
Prilagodljiva izbira sprožilnih pogojev | Uporaba več epruvet in več korakov pipetiranja poveča tveganje za kontaminacijo DNK, in zamudno.
Zahteva več optimizacije kot metoda v enem koraku |
Podobni izdelki:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (En korak)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (En korak)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix za sintezo prve verige CDNA
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
PCR v realnem času Easyᵀᴹ-Taqman
Izbor celotne RNA in mRNA
Pri načrtovanju poskusa RT-qPCR je pomembno, da se odločite, ali boste kot predlogo za reverzno transkripcijo uporabili celotno RNA ali prečiščeno mRNA.Čeprav lahko mRNA zagotovi nekoliko večjo občutljivost, se totalna RNA še vedno pogosto uporablja.Razlog za to je, da ima skupna RNA pomembnejšo prednost kot začetni material kot mRNA.Prvič, postopek zahteva manj korakov čiščenja, kar zagotavlja boljšo kvantitativno obnovitev predloge in boljšo normalizacijo rezultatov na začetno število celic.Drugič, izogne se koraku obogatitve mRNA, s čimer se lahko izognemo možnosti izkrivljenih rezultatov zaradi različnih obnovitev različnih mRNA.Ker je na splošno v večini aplikacij relativna kvantifikacija ciljnega gena pomembnejša od absolutne občutljivosti detekcije, je v večini primerov primernejša celotna RNA.
Primer reverzne transkripcije
Pri dvostopenjski metodi se lahko za pripravo reakcije cDNA uporabijo tri različne metode: oligo(dT) primerji, naključni primerji ali zaporedje specifični začetniki.Običajno se oligo(dT) primerji in naključni primerji uporabljajo v kombinaciji.Ti primerji se prižgejo na vzorčno verigo mRNA in zagotovijo reverzno transkriptazo z izhodiščem za sintezo.
Izbira primerja | Zgradba in funkcija | Prednost | Slabost |
Oligo(dT) primer (ali zasidrani oligo(dT) primer) | Podaljšano žarjenje na ostanke timina na poli(A) repu mRNA;sidrni oligo(dT) primer vsebuje G, C ali A na 3' koncu (sidrno mesto) | Sinteza cDNA polne dolžine iz mRNA s poli(A)-repom
Uporablja se, kadar je na voljo manj izhodnega materiala
Mesto sidranja zagotavlja, da se oligo(dT) primer veže na 5' poli(A) rep mRNA | Primerno le za pomnoževanje genov s poli(A) repi
Pridobite cDNA, skrajšano iz začetnega mesta*2 v poli(A)
Pristranski za vezavo na 3' konec*
*Ta možnost je zmanjšana, če se uporabljajo zasidrani oligo(dT) primerji |
naključni primer
| 6 do 9 baz v dolžino, ki se lahko med transkripcijo RNK prižgejo na več mestih | Sežiganje z vsemi RNA (tRNA, rRNA in mRNA)
Primerno za prepise s pomembno sekundarno strukturo ali kadar je na voljo manj izhodnega materiala
Visok izkoristek cDNA | cDNA se reverzno prepisuje iz vse RNA, kar običajno ni zaželeno in lahko oslabi signal ciljne mRNA
dobimo okrnjeno cDNA |
primerji, specifični za zaporedje | Primerji po meri, ki ciljajo na specifične sekvence mRNA | specifična knjižnica cDNA
Izboljšajte občutljivost
Uporaba reverznih primerjev qPCR | Omejeno samo na sintezo enega samega ciljnega gena |
Reverzna transkriptaza
Reverzna transkriptaza je encim, ki uporablja RNA za sintezo DNA.Nekatere reverzne transkriptaze imajo aktivnost RNAze in lahko po transkripciji razgradijo verige RNA v hibridnih verigah RNA-DNA.Če nima encimske aktivnosti RNaze, se lahko doda RNazaH za večjo učinkovitost qPCR.Pogosto uporabljeni encimi vključujejo reverzno transkriptazo virusa mišje levkemije Moloney in reverzno transkriptazo virusa ptičjega mieloblastoma.Za RT-qPCR je idealno izbrati reverzno transkriptazo z višjo termostabilnostjo, tako da se lahko sinteza cDNA izvaja pri višjih temperaturah, kar zagotavlja uspešno prepisovanje RNA z višjo sekundarno strukturo, hkrati pa ohranja njihovo polno aktivnost skozi celotno reakcijo, kar ima za posledico višje donose cDNA.
Podobni izdelki:
Reverzna transkriptaza Foreasy M-MLV
Aktivnost RNaze H reverzne transkriptaze
RNaseH lahko razgradi verige RNA iz dupleksov RNA-DNA, kar omogoča učinkovito sintezo dvoverižne DNA.Vendar pa se lahko pri uporabi dolge mRNA kot predloge RNA prezgodaj razgradi, kar povzroči okrnjeno cDNA.Zato je pogosto koristno zmanjšati aktivnost RNAseH med kloniranjem cDNA, če je zaželena sinteza dolgih transkriptov.V nasprotju s tem so reverzne transkriptaze z aktivnostjo RNaze H pogosto koristne za aplikacije qPCR, ker izboljšajo taljenje dupleksov RNA-DNA med prvim ciklom PCR.
Primerno oblikovanje
Primerji PCR, ki se uporabljajo za korak qPCR v RT-qPCR, bi morali biti v idealnem primeru zasnovani tako, da zajemajo stičišče ekson-ekson, kjer lahko primer za pomnoževanje potencialno zajema dejansko mejo ekson-intron.Ker zaporedja genomske DNA, ki vsebujejo introne, niso pomnožena, ta zasnova zmanjšuje tveganje lažno pozitivnih rezultatov, pomnoženih zaradi kontaminacije genomske DNA.
Če primerjev ni mogoče oblikovati za ločevanje eksonov ali meja ekson-ekson, bo morda treba vzorce RNA obdelati z DNazo I ali dsDNazo brez RNaze, da se odstrani kontaminacija genomske DNA.
Kontrola RT-qPCR
V vse poskuse RT-qPCR je treba vključiti negativno kontrolo reverzne transkripcije (kontrola -RT) za odkrivanje kontaminacije DNA (kot so genomska DNA ali produkti PCR iz prejšnjih reakcij).Ta kontrola vsebuje vse reakcijske komponente razen reverzne transkriptaze.Ker pri tej kontroli ne pride do reverzne transkripcije, je kontaminacija z DNA najverjetnejša, če opazite PCR pomnoževanje.
Čas objave: 2. avgust 2022