• facebook
  • linkedin
  • youtube

Izhodiščni material: RNA

Kvantitativna reverzna transkripcija PCR (RT-qPCR) je eksperimentalna metoda, ki se uporablja v poskusih PCR z uporabo RNA kot izhodiščnega materiala.Pri tej metodi se celotna RNA ali messenger RNA (mRNA) najprej prepiše v komplementarno DNA (cDNA) z reverzno transkriptazo.Nato je bila izvedena reakcija qPCR z uporabo cDNA kot predloge.RT-qPCR je bil uporabljen v različnih aplikacijah molekularne biologije, vključno z analizo izražanja genov, validacijo motenj RNA, validacijo mikromrež, odkrivanjem patogenov, genetskim testiranjem in raziskavami bolezni.

Enostopenjske in dvostopenjske metode za RT-qPCR

RT-qPCR se lahko izvede z enostopenjsko ali dvostopenjsko metodo.Enostopenjski RT-qPCR združuje reverzno transkripcijo in pomnoževanje PCR, kar omogoča, da reverzna transkriptaza in DNA polimeraza zaključita reakcijo v isti epruveti pod enakimi pogoji pufra.Enostopenjski RT-qPCR zahteva samo uporabo primerjev, specifičnih za zaporedje.V dvostopenjskem RT-qPCR se reverzna transkripcija in pomnoževanje PCR izvajata v dveh epruvetah z uporabo različnih optimiziranih pufrov, reakcijskih pogojev in strategij zasnove primerja.

člen1

 

Prednost

Slabost

En korak Ta metoda ima manjšo eksperimentalno napako, saj obe reakciji potekata v eni epruveti

 

Manj korakov pipetiranja zmanjša tveganje kontaminacije

 

Primerno za visokozmogljivo ojačanje/pregledovanje, hitro in ponovljivo

Dvostopenjskih reakcij ni mogoče optimizirati ločeno

 

Ker so reakcijski pogoji ogroženi s kombiniranjem dvostopenjske reakcije, občutljivost ni tako dobra kot pri dvostopenjski metodi

 

Število tarč, ki jih odkrije en vzorec, je majhno

Dva koraka Sposobnost ustvarjanja stabilnih knjižnic cDNA, ki jih je mogoče shraniti za daljša obdobja in uporabiti v več reakcijah

 

Ciljne gene in referenčne gene je mogoče pomnožiti iz iste knjižnice cDNA brez potrebe po več knjižnicah cDNA

 

Reakcijski pufri in reakcijski pogoji, ki omogočajo optimizacijo potekov posamezne reakcije

 

Prilagodljiva izbira sprožilnih pogojev

Uporaba več epruvet in več korakov pipetiranja poveča tveganje za kontaminacijo DNK,

in zamudno.

 

Zahteva več optimizacije kot metoda v enem koraku

Podobni izdelki:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (En korak)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (En korak)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix za sintezo prve verige CDNA

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

PCR v realnem času Easyᵀᴹ-Taqman

Izbor celotne RNA in mRNA

Pri načrtovanju poskusa RT-qPCR je pomembno, da se odločite, ali boste kot predlogo za reverzno transkripcijo uporabili celotno RNA ali prečiščeno mRNA.Čeprav lahko mRNA zagotovi nekoliko večjo občutljivost, se totalna RNA še vedno pogosto uporablja.Razlog za to je, da ima skupna RNA pomembnejšo prednost kot začetni material kot mRNA.Prvič, postopek zahteva manj korakov čiščenja, kar zagotavlja boljšo kvantitativno obnovitev predloge in boljšo normalizacijo rezultatov na začetno število celic.Drugič, izogne ​​se koraku obogatitve mRNA, s čimer se lahko izognemo možnosti izkrivljenih rezultatov zaradi različnih obnovitev različnih mRNA.Ker je na splošno v večini aplikacij relativna kvantifikacija ciljnega gena pomembnejša od absolutne občutljivosti detekcije, je v večini primerov primernejša celotna RNA.

Primer reverzne transkripcije

Pri dvostopenjski metodi se lahko za pripravo reakcije cDNA uporabijo tri različne metode: oligo(dT) primerji, naključni primerji ali zaporedje specifični začetniki.Običajno se oligo(dT) primerji in naključni primerji uporabljajo v kombinaciji.Ti primerji se prižgejo na vzorčno verigo mRNA in zagotovijo reverzno transkriptazo z izhodiščem za sintezo.

člen2

Izbira primerja Zgradba in funkcija Prednost Slabost
Oligo(dT) primer (ali zasidrani oligo(dT) primer) Podaljšano žarjenje na ostanke timina na poli(A) repu mRNA;sidrni oligo(dT) primer vsebuje G, C ali A na 3' koncu (sidrno mesto) Sinteza cDNA polne dolžine iz mRNA s poli(A)-repom

 

Uporablja se, kadar je na voljo manj izhodnega materiala

 

Mesto sidranja zagotavlja, da se oligo(dT) primer veže na 5' poli(A) rep mRNA

Primerno le za pomnoževanje genov s poli(A) repi

 

Pridobite cDNA, skrajšano iz začetnega mesta*2 v poli(A)

 

Pristranski za vezavo na 3' konec*

 

*Ta možnost je zmanjšana, če se uporabljajo zasidrani oligo(dT) primerji

naključni primer

 

6 do 9 baz v dolžino, ki se lahko med transkripcijo RNK prižgejo na več mestih Sežiganje z vsemi RNA (tRNA, rRNA in mRNA)

 

Primerno za prepise s pomembno sekundarno strukturo ali kadar je na voljo manj izhodnega materiala

 

Visok izkoristek cDNA

cDNA se reverzno prepisuje iz vse RNA, kar običajno ni zaželeno in lahko oslabi signal ciljne mRNA

 

dobimo okrnjeno cDNA

primerji, specifični za zaporedje Primerji po meri, ki ciljajo na specifične sekvence mRNA specifična knjižnica cDNA

 

Izboljšajte občutljivost

 

Uporaba reverznih primerjev qPCR

Omejeno samo na sintezo enega samega ciljnega gena

Reverzna transkriptaza

Reverzna transkriptaza je encim, ki uporablja RNA za sintezo DNA.Nekatere reverzne transkriptaze imajo aktivnost RNAze in lahko po transkripciji razgradijo verige RNA v hibridnih verigah RNA-DNA.Če nima encimske aktivnosti RNaze, se lahko doda RNazaH za večjo učinkovitost qPCR.Pogosto uporabljeni encimi vključujejo reverzno transkriptazo virusa mišje levkemije Moloney in reverzno transkriptazo virusa ptičjega mieloblastoma.Za RT-qPCR je idealno izbrati reverzno transkriptazo z višjo termostabilnostjo, tako da se lahko sinteza cDNA izvaja pri višjih temperaturah, kar zagotavlja uspešno prepisovanje RNA z višjo sekundarno strukturo, hkrati pa ohranja njihovo polno aktivnost skozi celotno reakcijo, kar ima za posledico višje donose cDNA.

Podobni izdelki:

Reverzna transkriptaza Foreasy M-MLV

Aktivnost RNaze H reverzne transkriptaze

RNaseH lahko razgradi verige RNA iz dupleksov RNA-DNA, kar omogoča učinkovito sintezo dvoverižne DNA.Vendar pa se lahko pri uporabi dolge mRNA kot predloge RNA prezgodaj razgradi, kar povzroči okrnjeno cDNA.Zato je pogosto koristno zmanjšati aktivnost RNAseH med kloniranjem cDNA, če je zaželena sinteza dolgih transkriptov.V nasprotju s tem so reverzne transkriptaze z aktivnostjo RNaze H pogosto koristne za aplikacije qPCR, ker izboljšajo taljenje dupleksov RNA-DNA med prvim ciklom PCR.

Primerno oblikovanje

Primerji PCR, ki se uporabljajo za korak qPCR v RT-qPCR, bi morali biti v idealnem primeru zasnovani tako, da zajemajo stičišče ekson-ekson, kjer lahko primer za pomnoževanje potencialno zajema dejansko mejo ekson-intron.Ker zaporedja genomske DNA, ki vsebujejo introne, niso pomnožena, ta zasnova zmanjšuje tveganje lažno pozitivnih rezultatov, pomnoženih zaradi kontaminacije genomske DNA.

Če primerjev ni mogoče oblikovati za ločevanje eksonov ali meja ekson-ekson, bo morda treba vzorce RNA obdelati z DNazo I ali dsDNazo brez RNaze, da se odstrani kontaminacija genomske DNA.

Kontrola RT-qPCR

V vse poskuse RT-qPCR je treba vključiti negativno kontrolo reverzne transkripcije (kontrola -RT) za odkrivanje kontaminacije DNA (kot so genomska DNA ali produkti PCR iz prejšnjih reakcij).Ta kontrola vsebuje vse reakcijske komponente razen reverzne transkriptaze.Ker pri tej kontroli ne pride do reverzne transkripcije, je kontaminacija z DNA najverjetnejša, če opazite PCR pomnoževanje.


Čas objave: 2. avgust 2022