V zgodnji fazi izbruha je zaradi hitrega razvoja hitra diagnostika sumljivih bolnikov ključna za preprečevanje COVID-19.Nekateri odobreni reagenti za odkrivanje nukleinske kisline imajo kratek razvojni čas in obstajajo težave, kot so hitra potrditev delovanja, nezadostna optimizacija reagenta in velike razlike med serijami;Težave različnih kliničnih laboratorijev v različnih vidikih procesa detekcije nukleinske kisline lahko vplivajo tudi na točnost rezultatov detekcije nukleinske kisline.Ta članek se bo osredotočil na ključne povezave in točke v trenutni detekciji nukleinske kisline SARS-CoV-2 ter analiziral probleme lažno negativnih in pozitivnih ponovnih preiskav laboratorijske detekcije nukleinske kisline in klinično nedoslednost.

Načela detekcije nukleinske kisline SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 je virus RNA z zaporedjem genoma približno 29 kb, z 10 geni, ki lahko učinkovito kodirajo 10 proteinov.Virusi so sestavljeni iz RNK in beljakovin, najbolj zunanja plast pa je zunanja prevleka, sestavljena iz lipidov in glikoproteinov.V notranjosti beljakovinska kapsida ovije RNA in s tem zaščiti lahko razgradljivo RNA (P1).

P1 Struktura SARS-COV-2

Virusi vdrejo v celice prek specifičnih receptorjev na celični površini, da povzročijo okužbo in uporabijo gostiteljske celice za razmnoževanje.

Načelo odkrivanja virusne nukleinske kisline je, da se virusna RNA izpostavi skozi celični lizat in nato za odkrivanje uporabi fluorescentna verižna reakcija s polimerazno reverzno transkripcijo (RT-PCR).

Ključ do načela odkrivanja je uporaba primerjev in sond za doseganje »ciljno ujemanja« zaporedij nukleinske kisline, to je iskanje zaporedja nukleinske kisline SARS-CoV-2, ki se razlikuje od drugih virusov v približno 30.000 bazah (podobnost nukleinske kisline z drugimi virusi) »Nizko« območje), oblikovanje primerjev in sond.

Primerji in sonde se zelo ujemajo s specifično regijo nukleinske kisline SARS-CoV-2, kar pomeni, da je specifičnost zelo močna.Ko je rezultat fluorescenčne RT-PCR pomnožitve vzorca, ki ga je treba testirati, v realnem času pozitiven, to dokazuje, da je SARS-CoV-2 prisoten v vzorcu.Glej P2.

P2 Koraki določanja nukleinske kisline SARS-CoV-2 (fluorescentna RT-PCR v realnem času)

Pogoji in zahteve laboratorija za dokazovanje nukleinske kisline SARS-CoV-2

Laboratoriji za testiranje nukleinske kisline so najbolj idealni za okolja z negativnim tlakom, zato morajo biti pozorni na spremljanje tlaka, ohranjati pretok zraka in odstraniti aerosole.Osebje, ki izvaja testiranje nukleinske kisline, mora imeti ustrezne kvalifikacije, opraviti ustrezno usposabljanje za verižno reakcijo s polimerazo in opraviti ocenjevanje.Laboratorij je treba strogo upravljati, v conah, nepomembnemu osebju pa je strogo prepovedan vstop.Čist prostor je treba prezračevati in razkužiti na mestu.Ustrezni predmeti so postavljeni v cone, čisti in umazani so ločeni, pravočasno zamenjani in dekontaminirani na mestu.Rutinsko razkuževanje: za večje površine je glavna rešitev razkužilo, ki vsebuje klor, za manjše pa lahko uporabimo 75% alkohol.Dober način za ravnanje z aerosoli je odpiranje oken za prezračevanje, dezinfekcijo zraka pa lahko izvajamo tudi z ultravijoličnimi žarki, filtracijo in dezinfekcijo zraka.

Ključne povezave in parametri določanja nukleinske kisline SARS-CoV-2 (fluorescentna RT-PCR v realnem času)

Čeprav laboratoriji na splošno posvečajo veliko pozornosti »odkrivanju« nukleinske kisline, je pravzaprav tudi »ekstrakcija« nukleinske kisline eden ključnih korakov za uspešno odkrivanje, ki je tesno povezano z zbiranjem in shranjevanjem vzorcev virusa.

Trenutno najbolj razširjeni respiratorni vzorci, kot so nazofaringealni brisi, uporabljajo drugo metodo, ki je inaktivacijska (konzervirana) raztopina, pripravljena na osnovi ekstrakcije nukleinske kisline in raztopine za lizo.Po eni strani lahko ta rešitev za ohranjanje virusa denaturira beljakovine virusa, izgubi svojo aktivnost in ni več nalezljiva ter izboljša varnost transporta in stopnje odkrivanja;po drugi strani pa lahko neposredno razbije virus, da sprosti nukleinsko kislino, odstrani encim, ki razgrajuje nukleinsko kislino, in prepreči virus.RNA se razgradi.

Raztopina za vzorčenje virusa, pripravljena na osnovi lizne raztopine za ekstrakcijo nukleinske kisline.Glavne sestavine so uravnotežene soli, etilendiaminetetraocetno kislinsko sredstvo, gvanidinsko sol (gvanidin izotiocianat, gvanidin hidroklorid itd.), Anionska površinsko aktivna snov (Dodekana) natrijeva sulfat), kationska površina (tetradetil, fnola (tetradetilna amomonija) , ditiotreitol, proteinaza K in druge več ali več komponent.Trenutno obstaja veliko vrst kompletov za ekstrakcijo nukleinske kisline in uporabljajo se različni reagenti za ekstrakcijo in čiščenje nukleinske kisline.Tudi če se uporabi isti reagent za ekstrakcijo in čiščenje nukleinske kisline, so postopki ekstrakcije vsakega kompleta različni.

Trenutno so kompleti za odkrivanje nukleinske kisline, ki jih je odobrila Nacionalna uprava za medicinske izdelke, izbrani na podlagi genov ORF1ab, E in N v genomu SARS-CoV-2.Načela zaznavanja različnih izdelkov so v bistvu enaka, vendar se njihovi primerji in zasnove sond razlikujejo.Obstajajo enotarčni segmenti (ORF1ab), dvotarčni segmenti (ORF1ab, N ali E) in tritarčni segmenti (ORF1ab, N in E).Razlika med odkrivanjem in interpretacijo, ekstrakcijo nukleinske kisline in fluorescenčnim reakcijskim sistemom RT-PCR v realnem času se mora nanašati na ustrezna navodila za komplet, priporočljivo pa je, da uporabniki strogo upoštevajo metodo interpretacije, navedeno v navodilih kompleta za interpretacijo.Skupne regije, primerji in zaporedja sond, pomnoženi s fluorescentno RT-PCR v realnem času, so prikazani v P3.

P3 Lokacija tarče pomnožka SARS-CoV-2 na genomu ter zaporedje primerjev in sond

Interpretacija rezultatov določanja nukleinske kisline SARS-CoV-2 (Real-Time fluorescentna RT-PCR)

»Načrt za preprečevanje in obvladovanje pljučnice pri okužbi s SARS-CoV-2 (druga izdaja)« je prvič pojasnil merila za presojo rezultatov pomnoževanja enega gena:

1. Noben Ct ali Ct≥40 ni negativen;

2. Ct<37 je pozitiven;

3. Vrednost Ct 37-40 je območje sivine.Priporočljivo je ponoviti poskus.Če ima rezultat ponovitve Ct<40 in ima krivulja pomnoževanja očitne vrhove, se vzorec oceni kot pozitiven, sicer pa je negativen.«

Tretja izdaja vodnika in četrta izdaja vodnika sta nadaljevali zgoraj navedena merila.Vendar zaradi različnih tarč, ki se uporabljajo v komercialnih kompletih, prej omenjena 3. izdaja vodnika ni podala kriterijev za določitev kombinacije tarč, s poudarkom na tem, da prevladajo navodila proizvajalca.Od pete izdaje smernic sta bila razjasnjena dva cilja, zlasti merila presoje za posamezen cilj, ki ga je težko presojati.Če želi laboratorij potrditi, da je primer pozitiven na odkrivanje nukleinske kisline SARS-CoV-2, mora biti izpolnjen 1 od 2 pogojev:

(1) Dve tarči SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) v istem vzorcu sta bili pozitivni s fluorescentno RT-PCR v realnem času.Če je posamezna tarča pozitivna, sta potrebna ponovno vzorčenje in ponovno testiranje.Če so rezultati testa Če je posamezna tarča še vedno pozitivna, se oceni kot pozitivna.

(2) Dva vzorca fluorescentne RT-PCR v realnem času sta hkrati pokazala eno samo tarčo pozitivno ali pa sta dva vzorca iste vrste pokazala en tarčni pozitiven rezultat testa, ki se lahko oceni kot pozitiven.Vendar smernice tudi poudarjajo, da negativni rezultati testiranja nukleinske kisline ne morejo izključiti okužbe s SARS-CoV-2.Treba je izključiti dejavnike, ki lahko povzročijo lažno negativne rezultate, vključno s slabo kakovostjo vzorcev (respiratorni vzorci iz orofarinksa in drugih delov), prezgodnjim ali prepoznim odvzemom vzorcev, vzorci niso bili pravilno shranjeni, transportirani in obdelani, sama tehnologija pa je imela težave (variacije virusa, zaviranje PCR) itd.

Vzroki za lažno negativne rezultate pri odkrivanju SARS-CoV-2

Koncept »lažno negativnega« pri testiranju nukleinske kisline, ki je trenutno obravnavan, se pogosto nanaša na »lažno negativne rezultate«, pri katerih rezultati testa nukleinske kisline niso v skladu s kliničnimi manifestacijami, kar pomeni, da so klinični simptomi in rezultati slikanja močno sumljivi na COVID-19, vendar so testi nukleinske kisline vedno večkrat »negativni«.Klinični laboratorijski center Nacionalne zdravstvene komisije je pojasnil "lažno negativen" test SARS-CoV-2.

(1) V celicah okužene osebe je določena količina virusa.Obstoječi podatki kažejo, da virus po okužbi telesa z virusom vstopi v grlo skozi nos in usta, nato v sapnik in bronhije ter nato doseže pljučne mešičke.Okužena oseba bo doživela inkubacijsko dobo, blage simptome, nato pa proces hudih simptomov in različne stopnje bolezni.In količina virusa, prisotnega v različnih delih telesa, je različna.

Kar zadeva virusno obremenitev tipov celic, alveolarne epitelijske celice (spodnja dihala)> epitelijske celice dihalnih poti (zgornja dihala)> fibroblasti, endotelijske celice in makrofagi itd.;od vrste vzorca alveolarna izpiralna tekočina (najboljša)>globok izkašljevalec izpljunka>nazofaringealni bris>orofaringealni bris>kri.Poleg tega je virus mogoče odkriti tudi v blatu.Vendar pa je glede na priročnost delovanja in sprejemanje bolnikov običajno uporabljen klinični vrstni red vzorcev bris orofaringeusa>bris nosnožrelnega dela>bronhialna lavaža (zapletena operacija) in globok sputum (običajno suh kašelj, težko ga je dobiti) .

Zato je količina virusa v celicah orofarinksa ali nazofarinksa pri nekaterih bolnikih majhna ali izjemno nizka.Če se za testiranje vzamejo samo vzorci orofarinksa ali nazofarinksa, virusna nukleinska kislina ne bo odkrita.

(2) Med zbiranjem vzorcev niso bile zbrane celice, ki vsebujejo virus, ali pa virusna nukleinska kislina ni bila učinkovito ohranjena.

[① Nepravilno mesto odvzema, na primer pri zbiranju orofaringealnih brisov globina zbiranja ni zadostna, zbrani nazofaringealni brisi niso zbrani globoko v nosni votlini itd. Večina zbranih celic je lahko celic brez virusov;

②Bise za vzorčenje se uporabljajo nepravilno.Za material glave brisa se na primer priporočajo sintetična vlakna, kot so PE vlakna, poliestrska vlakna in polipropilenska vlakna.Naravna vlakna, kot je bombaž, se uporabljajo pri dejanskem delovanju (močna adsorpcija beljakovin in jih ni enostavno izprati) in najlonska vlakna (slaba absorpcija vode, kar vodi v nezadostno količino vzorca);

③Nepravilna uporaba epruvet za shranjevanje virusov, kot je zloraba polipropilenskih ali polietilenskih plastičnih epruvet za shranjevanje, ki zlahka absorbirajo nukleinske kisline (DNA/RNA), kar povzroči zmanjšanje koncentracije nukleinske kisline v raztopini za shranjevanje.V praksi je za shranjevanje virusnih nukleinskih kislin priporočljiva uporaba polimerne plastike iz polietilen-propilena in nekaterih posebej obdelanih plastičnih posod iz polipropilena.]

[① Nepravilno mesto odvzema, na primer pri zbiranju orofaringealnih brisov globina zbiranja ni zadostna, zbrani nazofaringealni brisi niso zbrani globoko v nosni votlini itd. Večina zbranih celic je lahko celic brez virusov;

②Bise za vzorčenje se uporabljajo nepravilno.Za material glave brisa se na primer priporočajo sintetična vlakna, kot so PE vlakna, poliestrska vlakna in polipropilenska vlakna.Naravna vlakna, kot je bombaž, se uporabljajo pri dejanskem delovanju (močna adsorpcija beljakovin in jih ni enostavno izprati) in najlonska vlakna (slaba absorpcija vode, kar vodi v nezadostno količino vzorca);

③Nepravilna uporaba epruvet za shranjevanje virusov, kot je zloraba polipropilenskih ali polietilenskih plastičnih epruvet za shranjevanje, ki zlahka absorbirajo nukleinske kisline (DNA/RNA), kar povzroči zmanjšanje koncentracije nukleinske kisline v raztopini za shranjevanje.V praksi je za shranjevanje virusnih nukleinskih kislin priporočljiva uporaba polimerne plastike iz polietilen-propilena in nekaterih posebej obdelanih plastičnih posod iz polipropilena.]

(4) Delovanje kliničnega laboratorija ni standardizirano.Pogoji transporta in shranjevanja vzorcev, standardizirano delovanje kliničnih laboratorijev, interpretacija rezultatov in kontrola kakovosti so ključni dejavniki za zagotavljanje točnosti in zanesljivosti rezultatov testov.Po rezultatih zunanjega ocenjevanja kakovosti, ki ga je Klinično laboratorijski center Nacionalne komisije za zdravje opravil od 16. do 24. marca 2020, je od 844 laboratorijev, ki so prejeli veljavne rezultate, 701 (83,1 %) usposobljenih, 143 (16,9 %) pa ne.Kvalificiran, splošni pogoji laboratorijskega testiranja so dobri, vendar imajo različni laboratoriji še vedno razlike v sposobnosti delovanja osebja, zmožnosti interpretacije pozitivnih vzorcev z enim ciljem in nadzoru kakovosti.

Kako zmanjšati lažno negativno odkrivanje nukleinske kisline SARS-CoV-2?

Zmanjšanje lažno negativnih rezultatov pri odkrivanju nukleinske kisline je treba optimizirati s štirimi vidiki proizvajanja lažno negativnih rezultatov.

(1) V celicah okužene osebe je določena količina virusa.Koncentracija virusa v različnih delih telesa domnevno okuženih oseb bo ob različnih časih različna.Če žrela ni, je lahko v tekočini za izpiranje bronhijev ali blatu.Če je za testiranje mogoče zbrati več vrst vzorcev hkrati ali na različnih stopnjah napredovanja bolezni, bo to pomagalo preprečiti lažno negativne rezultate.

(2) Celice, ki vsebujejo virus, je treba zbrati med zbiranjem vzorcev.To težavo je mogoče v veliki meri rešiti s krepitvijo usposabljanja zbiralcev vzorcev.

(3) Zanesljivi reagenti za IVD.Z izvajanjem raziskav o vrednotenju učinkovitosti odkrivanja reagentov na nacionalni ravni in razpravo o obstoječih problemih je mogoče dodatno izboljšati učinkovitost odkrivanja reagentov in izboljšati občutljivost analize.

(4) Standardizirano delovanje kliničnih laboratorijev.S krepitvijo usposabljanja laboratorijskega osebja, nenehnim izboljševanjem sistema vodenja laboratorijske kakovosti, zagotavljanjem razumnih delitev in izboljšanjem sposobnosti odkrivanja osebja je možno zmanjšati število lažno negativnih rezultatov zaradi neustreznega delovanja laboratorija.

Razlogi za ponovni pozitiven rezultat testa nukleinske kisline SARS-CoV-2 pri okrevajočih in odpuščenih bolnikih

»Načrt za diagnosticiranje in zdravljenje COVID-19 (poskusna sedma izdaja)« jasno določa, da je eden od kriterijev za ozdravitev in odpust bolnikov s COVID-19 ta, da imata dva zaporedna vzorca respiratornega trakta negativen test nukleinske kisline (v razmaku vsaj 24 ur), vendar jih je zelo malo Test nukleinske kisline SARS-CoV-2 je bil ponovno pozitiven pri odpuščenih bolnikih zaradi različnih razlogov.

(1) SARS-CoV-2 je nov virus.Potrebno je nadalje razumeti njegov patogeni mehanizem, celotno sliko povzročene bolezni in značilnosti poteka bolezni.Zato je po eni strani treba okrepiti obravnavo odpuščenih bolnikov in izvajati 14-dnevno zdravniško opazovanje.Izvajati spremljanje, spremljanje zdravja in zdravstveno usmerjanje za poglobitev razumevanja celotnega procesa nastanka, razvoja in izida bolezni.

(2) Bolnik se lahko ponovno okuži z virusom.Akademik Zhong Nanshan je dejal: Ker imajo ozdravljeni bolniki protitelesa, lahko SARS-CoV-2 odstranijo protitelesa, ko ponovno vdrejo.Vzrokov, ki so lahko vzrok za ozdravelega bolnika, je veliko ali pa je to povezano z mutacijo virusa ali celo vzrok laboratorijskih preiskav.Če je virus sam, lahko mutacija SARS-CoV-2 povzroči, da protitelesa, ki jih proizvede ozdraveli bolnik, niso učinkovita proti mutiranemu virusu.Če se bolnik ponovno okuži z mutiranim virusom, je lahko test nukleinske kisline ponovno pozitiven.

(3) Kar zadeva laboratorijske preskusne metode, ima vsaka preskusna metoda svoje omejitve.Zaznavanje nukleinske kisline SARS-CoV-2 je posledica izbire genskega zaporedja, sestave reagentov, občutljivosti metode in drugih razlogov, zaradi katerih imajo obstoječi kompleti svoje spodnje meje zaznavnosti.Po zdravljenju se virus v telesu zmanjša.Ko je virusna obremenitev v vzorcu za testiranje pod spodnjo mejo zaznavnosti, se prikaže "negativen" rezultat.Vendar ta rezultat ne pomeni, da je virus v telesu popolnoma izginil.Virus se lahko pojavi po prekinitvi zdravljenja.Resurgence«, nadaljujte s kopiranjem.Zato je priporočljiv pregled enkrat tedensko v 2 do 4 tednih po odpustu.

(4) Nukleinska kislina je genetski material virusa.Virus po končanem protivirusnem zdravljenju umre, vendar se preostali fragmenti virusne RNA še vedno zadržijo v človeškem telesu in se ne izločijo v celoti iz telesa.Včasih se lahko v določenih okoliščinah bolj obdrži.Dolgo časa in v tem času bo test nukleinske kisline "prehodno" pozitiven.S podaljšanjem pacientovega časa okrevanja, ko se preostali fragmenti RNA v telesu postopoma izčrpajo, lahko rezultat testa nukleinske kisline postane negativen.

(5) Rezultat testa nukleinske kisline SARS-CoV-2 dokazuje le prisotnost ali odsotnost virusne RNK, ne more pa dokazati aktivnosti virusa in ali je virus prenosljiv.Treba je dokazati, ali bo bolnik, ki ima ponovno pozitiven test nukleinske kisline, ponovno postal vir okužbe.Potrebno je opraviti kulturo virusa na kliničnih vzorcih in kultivirati "živ" virus, da se dokaže, da je kužen.

Povzetek

Če povzamemo, lažno negativnim rezultatom testa nukleinske kisline SARS-CoV-2, pozitivnim rezultatom ponovnega testa in drugim stanjem, ki niso v skladu s kliničnimi manifestacijami, se ni mogoče popolnoma izogniti.Pri dejanskem presejanju in testiranju je priporočljivo združiti klinične simptome, slikovne preiskave (CT) in rezultate laboratorijskih testov (test nukleinske kisline + test protiteles, specifičnih za virus) za celovito diagnozo, da se prepreči zgrešena diagnoza in napačna diagnoza.Če se ugotovi, da so rezultati testa očitno neskladni s kliničnimi manifestacijami, je priporočljivo izvesti celovito analizo celotne preskusne povezave (povezave zbiranja vzorcev, kroženja in obdelave), da se izključi zgodnja okužba z virusom SARS-CoV-2, ponavljajoča se okužba ali kombinacija z drugimi respiratornimi virusnimi okužbami itd.Če razmere dopuščajo, je priporočljivo odvzem občutljivejših vzorcev, kot je sputum ali alveolarna lavage tekočina za ponovno preiskavo.

Podobni izdelki:

Komplet za odkrivanje nukleinske kisline SARS-CoV-2 (metoda fluorescentne sonde Multiplex PCR)