Avtorja: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Enota: bolnišnica Jiaozhou, bolnišnica Dongfang, pridružena univerzi Tongji

Trenutno je glavna vrsta vzorca za odkrivanje nukleinske kisline respiratornega patogena bris grla.Obstaja veliko vrst pogosto uporabljenih raztopin za konzerviranje vzorcev, ki jih je treba vse ohladiti ali zamrzniti za prevoz in shranjevanje;Težko je nadzorovati celoten proces nizke temperature med postopkom zbiranja in transporta ter težko zagotoviti nadzor kakovosti pred testiranjem vzorcev^[1-2].

RNaza (RNase) je endonukleaza, ki hidrolizira RNA, predvsem prekine fosfodiesterske vezi med nukleotidi.Molekula RNaze je zelo stabilna, v strukturi so disulfidne vezi, njena aktivnost pa ne zahteva prisotnosti dvovalentnih kationov, zato se RNaza ne denaturira enostavno in jo je enostavno renaturirati tudi po visoki temperaturi ali uporabi denaturantov.RNaze delimo na endogene in eksogene.Endogene RNaze se lahko sprostijo istočasno, ko se celice raztrgajo.Zato je odprava vloge endogenih RNaz zelo kritičen korak v procesu ekstrakcije RNK.Eksogene RNaze so zelo razširjene.RNaze obstajajo v zraku, človeški koži, laseh in slini, kar je pomemben razlog za enostavno razgradnjo RNK.^[3].

Podatkovna poizvedba

CANS-CL02-A009 »Uporaba smernic za akreditacijo kakovosti in usposobljenosti medicinskih laboratorijev na področju molekularne diagnostike« v tehničnih zahtevah predlaga, da se ustrezni standardi kakovosti vode oblikujejo glede na aplikacijo;Nepredušne posode za enkratno uporabo:

RNaza/razvrstitev

(1) RNaza A

Ribonukleaza A (RNase A), pridobljena iz goveje trebušne slinavke, je endoribonukleaza, ki lahko specifično napade 3' konec pirimidinskih ostankov na RNA, pri čemer reže citozin ali uracil, ki ga tvorijo sosednji nukleotidi.Fosfodiesterska vez, končni produkt reakcije je 3' pirimidinski nukleotid in oligonukleotid s 3' pirimidinskim nukleotidom na koncu.

(2) RNaza T1

Ribonukleaza T1 (RNase T1) izhaja iz Aspergillus orjzae, specifično deluje na 3'-terminalni fosfat gvanina, mesto cepitve pa je med 3' fosfatom gvanina in 5' hidroksilom sosednjih nukleotidov.Končni produkt reakcije je 3'gvanilna kislina in oligonukleotidni fragmenti s 3'gvanilno kislino na koncu.

(3) RNaza H

Ribonukleaza H (RNase H) je bila prvič odkrita v tkivu telečjega timusa, njen kodirni gen pa je bil kloniran v Escherichia coli.Lahko specifično razgradi DNK: verige RNK v hibridnih dupleksih RNK, kar ima za posledico oligonukleotide in mononukleotide s 3'-OH in 5'-monofosfatnimi konci, ne more razgraditi eno- ali dvoverižne DNK ali RNK.

RNaza

Delovanje in uporaba

Ribonukleaza lahko katalizira razgradnjo ribonukleinske kisline (RNA) in jo je mogoče sintetizirati umetno.Zdravilno mazilo se uporablja lokalno za zdravljenje poškodb in bolečin v sklepih.Glede na poročila lahko ribonukleaza spremeni metabolizem gostiteljske celice, zavira sintezo virusa, zavira širjenje virusa influence in vitro in zavira tvorbo virusa vakcinije in herpesa v piščančjih zarodkih.Klinična uporaba ribonukleaze dnevno intramuskularno injekcijo 180 mg, koristna za zdravljenje epidemičnega encefalitisa, ribonukleaza lahko katalizira razgradnjo ribonukleinske kisline (RNA) in jo je zdaj mogoče umetno sintetizirati.Zdravilno mazilo se uporablja lokalno za zdravljenje poškodb in bolečin v sklepih.Glede na poročila lahko ribonukleaza spremeni metabolizem gostiteljske celice, zavira sintezo virusa, zavira širjenje virusa influence in vitro in zavira tvorbo virusa vakcinije in herpesa v piščančjih zarodkih.Klinična uporaba ribonukleaze z dnevno intramuskularno injekcijo 180 mg je koristna za zdravljenje epidemičnega encefalitisa.

RNaza

Opredelitev zaviralca

Opredelitev enote zaviralca RNaze: Količina encima, ki je potrebna za zaviranje 50 % aktivnosti 5ng RNaze A, je ena enota.

Kako delujejo zaviralci RNaze

Gvanidin izotiocianat:

Gvanidin izotiocianat je organska spojina z molekulsko formulo C2H6N4S.Uporablja se predvsem v biološki medicini, kemičnih reagentih itd. Gvanidin izotiocianat je sredstvo za liziranje beljakovin in se pogosto uporablja kot glavna sestavina raztopine za liziro v molekularnih diagnostičnih reagentih.Lahko lizira tkivo, uniči celično strukturo in loči nukleinsko kislino od nukleoproteina ter ima močno denaturacijo v RNazo.Trenutno je najučinkovitejši zaviralec RNaze.

TRIzol je nov reagent za ekstrakcijo celotne RNK, ki lahko neposredno ekstrahira celotno RNK iz celic ali tkiv.Vsebuje snovi, kot sta fenol in gvanidin izotiocianat, ki lahko hitro porušita celice in zavirata nukleaze, ki jih sproščajo celice.

(Vendar je gvanidin izotiocianat nevaren za zdravje laboratorijskih raziskovalcev.)

RNasin:

Kisli glikoprotein, ekstrahiran iz podganjih jeter ali človeškega blastoderma.Rnazin je nekompetitivni inhibitor RNaze, ki se lahko veže na različne RNaze in jih inaktivira.

(Več podrobnosti: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hvisoka temperatura:

Visoka temperatura je tudi pogost način denaturacije beljakovin.

Dietilpirokarbonat (DEPC):

DEPC je močan, a nepopoln zaviralec RNaze, ki lahko zavre aktivnost RNaze s kombinacijo z aminokislinskim imidazolnim obročem aktivne skupine RNaze za denaturacijo proteinov.

Vanadil ribonukleozidni kompleks:

Kompleks, ki ga tvorijo ioni vanadijevega oksida in nukleozidi, ki se veže na RNazo v obliki prehodnih snovi, ki lahko skoraj popolnoma zavrejo aktivnost RNaze.

drugo:

Določen zaviralni učinek na RNazo imajo tudi SDS, sečnina, diatomejska zemlja itd.

Ocene strokovnjakov

Li Yujie glavni tehnik

Direktor laboratorijskega oddelka, bolnišnica Jiaozhou, bolnišnica Dongfang, povezana z univerzo Tongji

Da bi preprečili biorazgradnjo eksogene RNK, je treba med postopkom ekstrakcije RNK pogosto nositi maske, rokavice in pokrivala.Vsa steklovina mora biti pečena v sušilniku pri 200°C več kot 2 uri.Materiale, ki se uporabljajo za peko, kot je plastika, je treba obdelati z DEPC vodo in nato sprati z destilirano vodo.Reagenti ali naprave, ki se uporabljajo za ekstrakcijo, konzerviranje in identifikacijo RNA, bi morali biti namenjeni RNA in vzpostaviti je treba neodvisno območje delovanja RNA.

reference:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bakterije in virusi v nazofarinksu neposredno pred pojavom akutnih okužb spodnjih dihal pri avstralskih domorodnih otrocih [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] Oddelek za nadzor bolnišničnih okužb kitajskega združenja za preventivno medicino.Smernice za zbiranje in pregledovanje kliničnih mikrobnih vzorcev [J].Kitajski časopis za bolnišnične okužbe, 2018 (20): 3192-3200.

[3] »Klinični test Deset tisoč Zakaj Molecular Biology Test Volume«