Preverjanje učinkovitosti primerjev in sond v zgodnji fazi reagentov PCR in določanje najprimernejših reakcijskih pogojev sta predpogoja za zagotovitev nemotenega poteka formalnih poskusov.
Torej, kako naj potrdimo prvo sondo v zgodnji fazi?
Glavni indikatorji so izhodišče, krivulja ojačanja, vrednost ct, učinkovitost ojačanja, detekcija vzorca z nizko koncentracijo, CV itd.
Izhodišče
Osnovna črta je vodoravna črta na krivulji pomnoževanja PCR.V prvih nekaj ciklih reakcije pomnoževanja PCR se fluorescenčni signal ne spremeni veliko in tvori ravno črto.Ta ravna črta je osnovna črta.
Pri presejanju primerjalnih sond PCR bodite pozorni na to, ali je izhodiščna linija poravnana.Čistost koncentracije primerjalne sonde bo vplivala na izhodiščno linijo, na primer povzročila dvig ali padec izhodiščne linije.Osnovna linija je tudi zelo intuitiven indikator.
Krivulja ojačanja
Še en intuitiven indikator je oblika ojačevalne krivulje.Najbolje je imeti krivuljo v obliki črke S, da se izognete sekundarnemu ojačanju ali drugim nenormalnim krivuljam ojačanja.
Ct vrednost
Število ciklov, ki ustreza prevojni točki od osnovne črte do eksponentne rasti, je vrednost Ct.
Za isti vzorec različne primerjske sonde povzročijo različne pomnoževalne krivulje, na ustrezno vrednost Ct pa bosta vplivali učinkovitost pomnoževanja in stopnja interference.V teoriji velja, da je manjša vrednost Ct sonde primerja, ki jo izberemo, tem bolje.
Učinkovitost ojačanja
Ena najbolj zanesljivih in stabilnih metod za ocenjevanje učinkovitosti pomnoževanja PCR je standardna krivulja, ki jo raziskovalci tudi splošno priznavajo.Metoda vključuje izdelavo serije vzorcev za nadzor relativnega števila ciljnih predlog.Ti vzorci so običajno narejeni s serijskimi razredčitvami koncentriranih osnovnih raztopin, najpogosteje uporabljena je 10-kratna razredčitev.Z uporabo niza razredčenih vzorcev, uporabo standardnega programa qPCR za pomnoževanje, da dobimo vrednost Cq, in na koncu narišemo standardno krivuljo glede na koncentracijo vsakega vzorca in ustrezno vrednost Cq, da dobimo linearno enačbo Cq= -klgX0+b in učinkovitost pomnoževanja E=10(-1 /k)-1.Pri uporabi qPCR za kvantitativno analizo mora biti učinkovitost pomnoževanja v območju 90 %–110 % (3,6>k>3,1).
Zaznavanje vzorcev z nizko koncentracijo
Ko je koncentracija vzorca nizka, so stopnje detekcije različnih sond primerjev različne.Za ponovitev izberemo 20 vzorcev z nizko koncentracijo, sistem primer-sonda z najvišjo stopnjo detekcije pa je najboljši.
Koeficient variacije (CV)
10 podvojenih vzorcev je mogoče detektirati z različnimi začetnimi sondami v skladu z linijo standarda reagenta za detekcijo pomnoževanja nukleinske kisline.
Kvantitativni reagenti:
Natančnost
Natančnost znotraj ene serije mora izpolnjevati: koeficient variacije (CV, %) logaritemske vrednosti preskusne koncentracije je ≤5 %.Ko je koncentracija vzorca nizka, je koeficient variacije (CV, %) logaritma koncentracije detekcije ≤10 %
Kvalitativni reagenti:
Natančnost
Natančnost znotraj ene serije mora ustrezati:
(1) Koeficient variacije vrednosti Ct (CV, %) ≤5 %
Isti vzorec se testira vzporedno 10-krat, rezultati testa pa morajo biti skladni
Čas objave: 18. september 2021
