Verjamem, da se bo vsak vedno srečal s takšnimi ali drugačnimi težavami pri PCR reakcijah, a večino jih lahko razvrstimo v dve glavni težavi:

Premajhna amplifikacija genske predloge (amplifikacija);
Preveč pomnoževanja neciljnega gena.
Uporaba aditivov je ena od običajnih strategij za reševanje teh težav.Običajno ima vloga aditivov dva vidika:
sekundarna strukturagenov (sekundarna struktura);
Zmanjšajte nespecifično pripravo.
Danes vam bo urednik na kratko predstavil pogoste dodatke v reakcijah PCR in njihove funkcije.
Dodatki, ki zmanjšujejo sekundarno strukturo
sulfoksid(DMSO)
vzorci genovz visoko vsebnostjo GC.Vendar DMSO tudi močno zmanjša aktivnost polimeraze Taq.Zato mora vsak uravnotežiti dostopnost predloge in aktivnost polimeraze.Urednik predlaga, da lahko preizkusite različne koncentracije DSMO, na primer od 2 % do 10 %, da najdete koncentracijo, ki ustreza vašemu poskusu.
Neionski detergenti
Neionski detergenti, kot so 0,1-1 % Triton X-100, Tween 20 ali NP-40, običajno zmanjšajo sekundarno strukturo DNK.Čeprav lahko to poveča pomnoževanje vzorčnega gena, bo povzročilo tudi težave z nespecifičnim pomnoževanjem.Torej ti dodatki dobro delujejo pri reakcijah PCR z nizkim izkoristkom brez ostankov, vendar ne tako dobro pri reakcijah relativno nečiste PRC.Druga prednost neionskih detergentov je zmanjšanje kontaminacije s SDS.Običajno se med postopkom ekstrakcije DNA SDS prenese v korak PCR, kar močno zavira aktivnost polimeraze.Zato lahko dodajanje 0,5 % Tween-20 ali Tween-40 reakciji nevtralizira negativne učinke SDS.
Betain_
Betain lahko izboljša pomnoževanje DNA z zmanjšanjem tvorbe sekundarne strukture in je na splošno "skrivnostni" dodatek komercialnim kompletom PCR.Če želite uporabiti betain, dodajte betain ali betain monohidrat (betain ali betain monohidrat), ne pa tudi betain hidroklorida (betain HCl), nastavite na končno koncentracijo 1-1,7 M.Betain lahko tudi pomaga izboljšati specifičnost, ker odpravlja odvisnost sestave baznih parov od taljenja DNK/denaturacije DNK.
Dodatki za zmanjšanje nespecifičnega pražnjenja
Formamid
Formamid je pogosto uporabljen organski dodatek za PCR.Lahko se kombinira z glavnim in manjšim utorom v DNK, s čimer zmanjša stabilnost glavne dvojne vijačnice DNK in zniža temperaturo taljenja DNK.Koncentracija formamida, uporabljenega v poskusih PCR, je običajno 1%-5%.
Tetrametilamonijev klorid( TMAC)
Tetrametilamonijev klorid lahko poveča specifičnost hibridizacije (hibridizacijska specifičnost) in poveča temperaturo taljenja DNA.Tako lahko TMAC odstrani nespecifično pripravo in zmanjša napačno vezavo DNA in RNA.Če uporabljatedegenerirani primerjiv reakciji PCR ne pozabite dodati TMAC, ki se običajno uporablja v koncentraciji 15-100 mM.
Drugi pogosti dodatki
Poleg dveh zgoraj omenjenih kategorij aditivov obstaja veliko običajnih aditivov v reakcijah PCR, čeprav imajo različne funkcije, a so tudi zelo pomembni.
Magnezijev ion
Magnezijev ion je nepogrešljiv kofaktor (kofaktor) polimeraze, kar pomeni, da je brez magnezijevega iona polimeraza neaktivna.Vendar lahko preveč magnezijevih ionov vpliva tudi na učinkovitost polimeraze.Koncentracija magnezijevih ionov v vsaki reakciji PCR se bo razlikovala.Kelatna sredstva (kot je EDTA ali citrat), koncentracija dNTP in beljakovin vplivajo na koncentracijo magnezijevih ionov.Torej, če imate težave s poskusom PCR, lahko poskusite spremeniti različne koncentracije magnezijevih ionov, na primer z 1,0 na 4,0 mM, z vmesnimi intervali 0,5–1 mM.
Omeniti velja, da lahko večkratni cikli zamrzovanja in odmrzovanja vodijo do koncentracijske stratifikacije raztopine magnezijevega klorida.Zato ga morate pred vsako uporabo popolnoma raztopiti in pred uporabo dobro premešati.
Goveji serumski albumin(goveji albumin, BSA)
V poskusih molekularne kemije je goveji serumski albumin zelo pogost dodatek, zlasti pri prebavi z restrikcijskimi encimi in poskusih PCR.V reakcijah PCR je BSA v pomoč pri zmanjševanju kontaminantov, kot so fenolne spojine.Rečeno je tudi, da lahko zmanjša oprijem reaktantov na steno epruvete.V reakciji PCR lahko običajno koncentracija dodanega BSA doseže 0,8 mg/ml.
 
Podobni izdelki:
PCR junak(z barvilom)
PCR junak