Neposredna PCR je reakcija, ki neposredno uporablja živalska ali rastlinska tkiva za pomnoževanje brez ekstrakcije nukleinske kisline.V mnogih pogledih deluje neposredni PCR kot običajni PCR

Glavna razlika je pufer po meri, ki se uporablja pri direktni PCR, vzorec je mogoče neposredno izpostaviti reakciji PCR brez ekstrakcije nukleinske kisline, vendar obstajajo ustrezne zahteve za toleranco encimov in združljivost pufra, vključenega v reakcijo neposredne PCR.

Čeprav je v običajnih vzorcih več ali manj inhibitorjev PCR, lahko z neposrednim PCR še vedno dosežemo zanesljivo pomnoževanje pod delovanjem encimov in pufrov.Tradicionalna reakcija PCR zahteva visokokakovostno nukleinsko kislino kot predlogo, ki lahko zavira nemoten potek reakcije PCR, če predloga vsebuje beljakovine in druge nečistoče.Direktni PCR je trenutno ena bolj priljubljenih tehnologij na področju molekularne diagnostike.

01 Direktni PCR je bil prvotno uporabljen za živali in rastline

Najzgodnejša uporaba neposrednega PCR je na področju živali in rastlin, kot so kri, tkivo in dlaka podgan, mačk, piščancev, zajcev, ovc, goveda itd., rastlinski listi in semena itd., ki se uporabljajo za preučevanje genotipizacije, transgenih, odkrivanje plazmidov, analizo izločitve genov, identifikacijo vira DNK, identifikacijo vrst, analizo SNP in druga področja.

Ta polja imajo nekaj skupnih značilnosti, to je, da je vsebnost ciljnega gena razmeroma visoka in je ekstrakcija nukleinske kisline težavna, zato lahko neposredni PCR ne le prihrani čas in ima majhen vpliv na rezultate, ampak tudi prihrani stroške.

Neposredni PCR, ki se uporablja za odkrivanje patogenov, je stvar zadnjih let, nekateri proizvajalci PCR reagentov so pri uvajanju inovacij vložili veliko truda v to smer.Zlasti v tej epidemiji COVID-19 se je na trgu pojavilo veliko takšnih izdelkov za odkrivanje, kot je komplet za odkrivanje nukleinske kisline SARS-CoV-2 (metoda fluorescentne sonde Multiplex PCR), ki ga je raziskal in razvil Foregene, ki uporablja tehnologijo RT PCR v realnem času (rRT-PCR) za kvalitativno odkrivanje nukleinskih kislin SARS-CoV-2 v človeškem nazofarinksu ali ustni votlini. vzorci aringealnih brisov.

Foregene je eno od podjetij, ki uporablja tehnologijo Direct PCR za odkrivanje normalnih ORF1ab, N, E invarianta linije nukleinskih kislin v človeških vzorcih nazofaringealnih ali orofaringealnih brisov, kot so linija SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), linija B.1.351 (ZA), linija B.1.617 (IND) in linija P.1 (BR).

02  Reagenti, potrebni za neposredno PCR

Vzorec lizata

Vzorčni lizat lahko konfigurirate sami ali kupite.Zaradi razlike v sestavi različnih znamk lizata se sposobnost lizira razlikuje, nato pa bo čas lizira nekoliko drugačen.Na primer, za pripravo vzorcev živalskega tkiva se na splošno priporoča 30-minutna ali nočna liza, raztopina za lizo za viruse pa se giblje od 3 do 10 minut.

Glavna mešanica PCR

Priporočljivo je, da uporabite DNA polimerazo z vročim zagonom, da povečate specifično pomnoževanje in povečate sposobnost pomnoževanja.Jedro direktne PCR je visoko tolerantna polimeraza.

Odstranite ali zavrite komponente v vzorcu, ki vplivajo na pomnoževanje DNK

Ko je vzorec obdelan z lizatom, se bodo sprostili proteini, lipidi in drugi celični ostanki, ki bodo zavirali reakcijo PCR.Zato neposredni PCR zahteva dodatek ustrezne odstranitve ali zaviralcev za zmanjšanje vpliva teh dejavnikov.

03  Zbirka petih točk znanja neposrednega PCR

Prvič, Direct PCR tehnologija je neposredna PCR tehnologija za različne biološke vzorce.Pod tem tehničnim pogojem ni potrebe po ločevanju in ekstrahiranju nukleinske kisline, neposredni uporabi vzorca tkiva kot predmeta in dodajanju primerjev ciljnega gena za izvedbo reakcije PCR.

Drugič, tehnologija Direct PCR ni samo tradicionalna tehnologija pomnoževanja šablone DNK, ampak vključuje tudi PCR s povratno transkripcijo šablone RNA.

Tretjič, tehnologija Direct PCR ne samo neposredno izvaja rutinske kvalitativne reakcije PCR na vzorcih tkiv, ampak vključuje tudi reakcije qPCR v realnem času, ki zahtevajo, da ima reakcijski sistem močno zmožnost motenj fluorescence v ozadju in endogeno fluorescenco duši antagonistično sposobnost.

Četrtič, vzorci, na katere cilja tehnologija Direct PCR, potrebujejo le sprostitev predlog nukleinske kisline in ne odstranijo beljakovin, polisaharidov, ionov soli itd., ki motijo ​​reakcijo PCR.Kar zahteva, da imata polimeraza nukleinske kisline in mešanica PCR v reakcijskem sistemu odlično odpornost in prilagodljivost, da zagotovita encimsko aktivnost in natančnost replikacije v kompleksnih pogojih.

Petič, vzorec tkiva, na katerega cilja tehnologija Direct PCR brez kakršne koli obdelave obogatitve z nukleinsko kislino, in količina predloge je zelo majhna, kar zahteva, da ima reakcijski sistem izjemno visoko občutljivost in učinkovitost pomnoževanja.