Izjemna lastnost reakcije PCR je njena velika zmogljivost pomnoževanja in izjemno visoka občutljivost.Da bi izboljšali učinkovitost PCR in učinkovitost zaznavanja, smo zavezani izboljšanju zmogljivosti pomnoževanja PCR in občutljivosti zaznavanja, vendar je glavobol v procesu eksperimenta.Pogosto pride do lažno pozitivnih rezultatov in zelo majhna količina navzkrižne kontaminacije vzorca ali kontaminacije s PCR produktom lahko povzroči lažno pozitivne rezultate v poskusu.
Pet vrst kontaminacije produkta PCR
Obstaja veliko razlogov za PCR kontaminacijo, ki jih lahko grobo razdelimo v naslednje kategorije:
Do kontaminacije vzorca pride predvsem zaradi kontaminacije posode za zbiranje vzorca, ali ko je vzorec nameščen, izteče iz posode zaradi ohlapnega tesnjenja ali pa je vzorec prilepljen na zunanjo stran posode, kar povzroči navzkrižno kontaminacijo;Kontaminacija povzroči kontaminacijo med vzorci;nekateri mikrobni vzorci, zlasti virusi, se lahko širijo z aerosoli ali tvorijo aerosole, kar povzroči medsebojno kontaminacijo.
Glavni razlog je, da so med pripravo reagentov PCR pištola za vzorec, posoda, dvojno destilirana voda in druge raztopine kontaminirane s šablono nukleinske kisline PCR.
V laboratorijih za molekularno biologijo in nekaterih laboratorijih, ki uporabljajo klonirane plazmide kot pozitivne kontrole, je pogost tudi problem kontaminacije s kloniranimi plazmidi.Ker je vsebnost klonirnega plazmida v prostorninski enoti precej visoka in je v procesu čiščenja potrebnih več orodij in reagentov, je plazmid v živih celicah zelo verjetno kontaminiran zaradi močne rasti in sposobnosti razmnoževanja živih celic.
Kontaminacija pomnoženih produktov je najpogostejši problem kontaminacije pri reakcijah PCR.Ker je količina kopij produkta PCR velika (običajno 1013 kopij/ml), kar je veliko višje od meje števila kopij za odkrivanje PCR, lahko zelo majhna količina kontaminacije produkta PCR povzroči lažno pozitivne rezultate.
Onesnaženje z aerosoli je najverjetnejša oblika kontaminacije produktov PCR, ki jo je tudi najlažje spregledati.Nastane zaradi trenja med površino tekočine in zrakom.Na splošno lahko pride do kontaminacije z aerosolom, ko se pokrov odpre, ko se vzorec aspirira ali celo, ko se reakcijska epruveta močno stresa.Po izračunih lahko delec aerosola vsebuje 48.000 kopij, zato je onesnaženje, ki ga povzroča, problem, ki si zasluži posebno pozornost.
Zlasti testni laboratoriji pogosto uporabljajo isti par primerjev za testiranje določenega gena.Sčasoma se bo v laboratorijskem prostoru pojavila velika količina kontaminacije produkta PCR.Ko pride do takšne kontaminacije, jo je težko odpraviti v kratkem času.
Prvim trem vrstam onesnaženja se lahko izognemo z učinkovitimi sredstvi, vendar je onesnaženje, ki ga povzročajo produkti PCR, težko preprečiti, zlasti pri gradnji nestandardnih laboratorijev za PCR.Pri postopku PCR, ko konica pipete posesa in piha tekočino in se odpre pokrov cevi PCR, se tvori aerosol.Molekule DNK, ki jih prenaša aerosol (en aerosol lahko nosi več deset tisoč DNK), je težko odstraniti, ker lebdijo v zraku.Ko bo uveden naslednji krog poskusov PCR, se bodo neizogibno pojavili lažni pozitivni rezultati.
Kot je prikazano na spodnji sliki, je negativna kontrola povečala tudi ustrezen interesni pas:
Tukaj je predstavljen prvi del tega vprašanja PCR onesnaževanja in preprečevanja.Naslednja številka vam prinaša drugi del "Preprečevanje kontaminacije produktov PCR", zato nas spremljajte!
Čas objave: 25. julij 2017
