Tehnologija molekularne diagnostike uporablja metode molekularne biologije za odkrivanje izražanja in strukture genetskega materiala človeškega telesa in različnih patogenov, da se doseže namen napovedovanja in diagnosticiranja bolezni.

V zadnjih letih je z nadgradnjo in ponovitvijo tehnologije molekularne diagnostike klinična uporaba molekularne diagnostike postala vse bolj obsežna in poglobljena, trg molekularne diagnostike pa je vstopil v obdobje hitrega razvoja.

Avtor povzema običajne tehnologije molekularne diagnostike na trgu in je razdeljen na tri dele: prvi del predstavlja tehnologijo PCR, drugi del predstavlja tehnologijo izotermnega pomnoževanja nukleinske kisline in drugi del predstavlja tehnologijo sekvenciranja.

01

Del I: Tehnologija PCR

PCR tehnologija

PCR (verižna reakcija s polimerazo) je ena izmed in vitro tehnologij za pomnoževanje DNK z več kot 30-letno zgodovino.

Tehnologijo PCR je leta 1983 uvedel Kary Mullis iz Cetusa v ZDA.Mullis je leta 1985 zaprosil za patent PCR in istega leta objavil prvi akademski članek PCR o znanosti.Mullis je leta 1993 prejel Nobelovo nagrado za kemijo.

Osnovna načela PCR

PCR lahko pomnoži ciljne fragmente DNK za več kot milijonkrat.Načelo je, da se pri katalizi DNA polimeraze matična veriga DNA uporablja kot matrica, specifični primer pa se uporablja kot izhodišče za podaljšanje.Replicira se in vitro s koraki, kot so denaturacija, žarjenje in podaljšanje.Proces hčerinske verige DNK, ki je komplementarna matični DNK matične verige.

Standardni postopek PCR je razdeljen na tri korake:

1. Denaturacija: Za ločevanje dvojnih verig DNK uporabite visoko temperaturo.Vodikove vezi med dvojnimi verigami DNK se prekinejo pri visokih temperaturah (93-98°C).

2. Žarjenje: Ko je dvoverižna DNA ločena, se temperatura zniža, da se primer lahko veže na enoverižno DNA.

3. Podaljšanje: DNK polimeraza začne sintetizirati komplementarne verige vzdolž verig DNK iz vezanih primerjev, ko se temperatura zniža.Ko je podaljšek končan, je cikel sklenjen in število fragmentov DNK se podvoji.

Če te tri korake ponovite 25- do 35-krat, se bo število fragmentov DNK eksponentno povečalo.

Iznajdljivost PCR je v tem, da je mogoče oblikovati različne primerje za različne ciljne gene, tako da je mogoče fragmente ciljnega gena pomnožiti v kratkem času.

Do sedaj lahko PCR razdelimo v tri kategorije, in sicer navadni PCR, fluorescentni kvantitativni PCR in digitalni PCR.

Prva generacija navadnega PCR

Uporabite navaden instrument za pomnoževanje PCR za pomnoževanje ciljnega gena in nato z elektroforezo v agaroznem gelu zaznajte produkt, opravite lahko samo kvalitativno analizo.

Glavne slabosti prve generacije PCR:

-Nagnjenost k nespecifičnemu ojačanju in lažno pozitivnim rezultatom.

- Odkrivanje traja dolgo in operacija je okorna.

- Opraviti je mogoče samo kvalitativno testiranje.

Druga generacija fluorescenčne kvantitativne PCR

Fluorescenčni kvantitativni PCR (PCR v realnem času), znan tudi kot qPCR, se uporablja za spremljanje kopičenja pomnoženih produktov s kopičenjem fluorescentnih signalov z dodajanjem fluorescenčnih sond, ki lahko kažejo na napredek reakcijskega sistema, in za presojo rezultatov prek krivulje fluorescence, kvantificirati pa ga je mogoče s pomočjo vrednosti Cq in standardne krivulje.

Ker se tehnologija qPCR izvaja v zaprtem sistemu, je verjetnost kontaminacije zmanjšana, fluorescenčni signal pa je mogoče spremljati za kvantitativno detekcijo, zato je najbolj razširjena v klinični praksi in je postala prevladujoča tehnologija v PCR.

Fluorescentne snovi, ki se uporabljajo pri fluorescentni kvantitativni PCR v realnem času, lahko razdelimo na: fluorescenčne sonde TaqMan, molekularne svetilnike in fluorescentna barvila.

1) Fluorescentna sonda TaqMan:

Med PCR pomnoževanjem dodamo specifično fluorescenčno sondo in dodamo par primerjev.Sonda je oligonukleotid, oba konca pa sta označena z reportersko fluorescentno skupino in dušilno fluorescentno skupino.

Ko je sonda nedotaknjena, fluorescentni signal, ki ga oddaja reporterska skupina, absorbira dušilna skupina;med pomnoževanjem PCR eksonukleazna aktivnost 5'-3' encima Taq cepi in razgradi sondo, zaradi česar sta reporterska fluorescenčna skupina in dušilec. Fluorescentna skupina je ločena, tako da lahko sistem za spremljanje fluorescence sprejme fluorescenčni signal, kar pomeni, da vsakič, ko se veriga DNA pomnoži, nastane fluorescenčna molekula in kopičenje fluorescenčnega signala popolnoma sinhroniziran s tvorbo produkta PCR.

2) Fluorescentna barvila SYBR:

V reakcijskem sistemu PCR je dodan presežek fluorescentnega barvila SYBR.Ko je fluorescentno barvilo SYBR nespecifično vključeno v dvojno verigo DNA, oddaja fluorescentni signal.Molekula barvila SYBR, ki ni vključena v verigo, ne bo oddajala nobenega fluorescentnega signala, s čimer bo zagotovljen fluorescenčni signal Povečanje produktov PCR je popolnoma sinhronizirano s povečanjem produktov PCR.SYBR se veže le na dvoverižno DNA, zato se lahko s krivuljo taljenja ugotovi, ali je reakcija PCR specifična.

3) Molekularni svetilniki

Je dvojno označena oligonukleotidna sonda s steblom zanke, ki tvori lasno strukturo približno 8 baz na 5 in 3 koncu.Sekvence nukleinske kisline na obeh koncih so komplementarno seznanjene, zaradi česar sta fluorescenčna skupina in skupina za dušenje tesni.Zaprite, ne bo povzročil fluorescence.

Ko je produkt PCR ustvarjen, se med postopkom žarjenja srednji del molekularnega svetilnika poveže s specifičnim zaporedjem DNK in fluorescenčni gen se loči od dušilnega gena, da proizvede fluorescenco.

Glavne slabosti PCR druge generacije:

Občutljivost je še vedno pomanjkljiva in zaznavanje primerkov z nizko kopijo ni natančno.

Obstaja vpliv vrednosti ozadja in rezultat je dovzeten za motnje.

Digitalni PCR tretje generacije

Digitalni PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) izračuna število kopij ciljnega zaporedja z zaznavanjem končne točke in lahko izvede natančno absolutno kvantitativno zaznavanje brez uporabe notranjih kontrol in standardnih krivulj.

Digitalni PCR uporablja zaznavanje končne točke in ni odvisen od vrednosti Ct (prag cikla), zato učinkovitost pomnoževanja manj vpliva na reakcijo digitalne PCR, toleranca na zaviralce reakcije PCR pa je izboljšana z visoko natančnostjo in ponovljivostjo.

Zaradi lastnosti visoke občutljivosti in visoke natančnosti ga zaviralci reakcije PCR ne motijo ​​zlahka in lahko doseže resnično absolutno kvantifikacijo brez standardnih produktov, ki so postali žarišče raziskav in uporabe.

Glede na različne oblike reakcijske enote jo lahko razdelimo na tri vrste: mikrofluidne, čipne in kapljične sisteme.