Vrednost Ct je najpomembnejša oblika predstavitve rezultata fluorescentne kvantitativne PCR.Uporablja se za izračun razlik v izražanju genov ali števila genskih kopij.Kakšna je torej vrednost Ct kvantifikacije fluorescence, ki velja za razumno?Kako zagotoviti učinkovito območje vrednosti Ct?
Kaj je vrednost Ct?
Med postopkom pomnoževanja qPCR ustrezno število ciklov pomnoževanja (prag cikla), ko fluorescenčni signal pomnoženega produkta doseže nastavljeni prag fluorescence.C pomeni cikel, T pa prag.Preprosto povedano, vrednost Ct je število ciklov, ki ustrezajo, ko začetno pomnoževanje predloge doseže določeno količino produkta v qPCR.Tako imenovana "določena količina izdelka" bo podrobneje pojasnjena kasneje.
Kaj pomeni vrednost Ct?
1. Razmerje med eksponentnim ojačanjem, količino predloge in vrednostjo Ct
V idealnem primeru se geni v qPCR kopičijo z eksponentnim pomnoževanjem po določenem številu ciklov.Razmerje med številom ciklov pomnoževanja in količino produktov je: Količina pomnoženega produkta = količina začetne predloge × (1+En) število ciklov.Vendar pa reakcija qPCR ni vedno v idealni situaciji.Ko količina ojačanega produkta doseže "določeno količino produkta", je število ciklov v tem času vrednost Ct in je v eksponentnem obdobju ojačanja.Razmerje med vrednostjo Ct in količino začetne predloge: Obstaja linearna povezava med vrednostjo Ct predloge in logaritmom števila začetnih kopij predloge.Višja kot je začetna koncentracija predloge, manjša je vrednost Ct;nižja kot je začetna koncentracija predloge, večja je vrednost Ct.
2. Krivulja pomnoževanja, prag fluorescence in določena količina produkta PCR
Količina produkta pomnoževanja qPCR je neposredno predstavljena v obliki fluorescenčnega signala, to je pomnoževalne krivulje.V zgodnji fazi PCR je pomnoževanje v idealnih pogojih, število ciklov je majhno, kopičenje produkta je majhno in ravni fluorescence ni mogoče jasno ločiti od fluorescenčnega ozadja.Po tem se fluorescenca poveča in preide v eksponentno fazo.Količino produkta PCR je mogoče zaznati na določeni točki, ko je reakcija PCR ravno v eksponentni fazi, kar lahko uporabimo kot »določeno količino produkta«, iz tega pa je mogoče razbrati začetno vsebino predloge.Zato je intenziteta fluorescenčnega signala, ki ustreza določeni količini produkta, prag fluorescence.
V pozni fazi PCR krivulja pomnoževanja ne kaže več eksponentnega pomnoževanja in preide v linearno fazo in fazo platoja.
3. Ponovljivost vrednosti Ct
Ko cikel PCR doseže številko cikla vrednosti Ct, je pravkar vstopil v pravo eksponentno obdobje pomnoževanja.V tem času majhna napaka ni bila pomnožena, zato je ponovljivost vrednosti Ct odlična, kar pomeni, da je ista šablona pomnožena ob različnih časih ali v različnih epruvetah hkrati.Amplifikacija, dobljena vrednost Ct je konstantna.
1. Učinkovitost ojačanja En
Učinkovitost pomnoževanja PCR se nanaša na učinkovitost, s katero polimeraza pretvori gen, ki ga je treba pomnožiti, v pomnožek.Učinkovitost pomnoževanja, ko se ena molekula DNA transformira v dve molekuli DNA, je 100 %.Učinkovitost ojačanja je običajno izražena kot En.Za lažjo analizo naslednjih člankov so na kratko predstavljeni dejavniki, ki vplivajo na učinkovitost ojačanja.
| Vplivni dejavniki | razlaga | Kako soditi? |
| A. Zaviralci PCR | 1. Vzorčna DNK vsebuje snovi, ki zavirajo reakcijo PCR, kot so beljakovine ali detergenti.2. cDNA po reverzni transkripciji vsebuje visoko koncentracijo vzorčne RNA ali komponent reagenta RT, ki lahko zavrejo tudi kasnejšo reakcijo PCR. | 1. Ali gre za onesnaženje, lahko presodite z merjenjem razmerja A260/A280 in A260/A230 ali elektroforezo RNA.2. Ali je cDNA po reverzni transkripciji razredčena v skladu z določenim razmerjem. |
| B. Nepravilna zasnova temeljnega premaza | Primerji se ne žarijo učinkovito | Preverite temeljne premaze za primerje-dimerje ali lasnice, neujemanja in včasih obsegajoče intronic modele. |
| C. Nepravilna zasnova programa reakcije PCR | 1. Primerji se ne morejo učinkovito žariti2. Nezadostno sproščanje DNA polimeraze 3. Dolgotrajna visokotemperaturna aktivnost DNA polimeraze se je zmanjšala | 1. Temperatura žarjenja je višja od vrednosti TM primerja2. Čas pred denaturacijo je prekratek 3. Čas vsake stopnje reakcijskega postopka je predolg |
| D. Nezadostno mešanje reagentov ali napake pri pipetiranju | V reakcijskem sistemu je lokalna koncentracija reakcijskih komponent PCR previsoka ali neenakomerna, kar ima za posledico neeksponentno pomnoževanje pomnoževanja PCR | |
| E. Dolžina amplikona | Dolžina amplikona je predolga, presega 300 bp, učinkovitost ojačanja pa je nizka | Preverite, ali je dolžina pomnožka med 80–300 bp |
| F. Vpliv reagentov qPCR | Koncentracija DNA polimeraze v reagentu je nizka ali koncentracija ionov v pufru ni optimizirana, zaradi česar aktivnost encima Taq ne doseže maksimuma | Določitev učinkovitosti ojačanja s standardno krivuljo |
2.Razpon vrednosti Ct
Vrednosti Ct se gibljejo od 15-35.Če je vrednost Ct manjša od 15, se šteje, da je ojačanje v območju izhodiščnega obdobja in da prag fluorescence ni bil dosežen.V idealnem primeru obstaja linearna povezava med vrednostjo Ct in logaritmom začetnega števila kopij predloge, to je standardne krivulje.Skozi standardno krivuljo, ko je učinkovitost pomnoževanja 100 %, je izračunana vrednost Ct za kvantifikacijo števila posameznih kopij gena okoli 35. Če je večja od 35, je začetno število kopij predloge teoretično manjše od 1, kar se lahko šteje za nesmiselno.
Za različna območja Ct genov je zaradi razlike v številu kopij genov in učinkovitosti pomnoževanja v začetni količini predloge potrebno narediti standardno krivuljo za gen in izračunati linearno območje detekcije gena.
3. Vplivni dejavniki vrednosti Ct
Iz razmerja med številom ciklov pomnoževanja in količino produkta: količina pomnoženega produkta = količina začetne predloge × (1+En) številka cikla je razvidno, da bosta v idealnih pogojih količina začetne predloge in En negativno vplivala na vrednost Ct.Razlika v kakovosti predloge ali učinkovitosti ojačanja bo povzročila, da bo vrednost Ct prevelika ali premajhna.
4.Ct vrednost je prevelika ali premajhna
Čas objave: 22. februarja 2023
