Koliko veš

O Nekstrakcija ukleinske kisline

Začetek in konec prečiščene nukleinske kisline

Vse je na začetku težko, prečiščena nukleinska kislina je najbolj

Začetek molekularnih poskusov za nadaljnje poskuse

Uspeh ali neuspeh ima odločilen vpliv.

UV spektrofotometer v sledovih/ultra sledovih daje prednost številnim znanstvenim raziskovalcem, ker lahko preprosto, hitro in ekonomično zazna koncentracijo nukleinske kisline ter ostanke ionov beljakovin in soli.

Kot vsi vemo, A260 pomeni OD vrednost absorbance nukleinske kisline, A280 pomeni OD vrednost absorbance koncentracije beljakovin, A230 pomeni OD vrednost absorbance koncentracije ionov soli, tako da lahko A260 pretvori koncentracijo nukleinske kisline, A260/280 pomeni ostanek beljakovin, A260/230 pomeni ostanek ionov soli, vendar je to samo pravilo, ki so ga odkrili raziskovalci na podlagi velikega števila rezultatov meritev, in je ”konvencionalni” verjeti, da lahko pojasni čistost DNK in RNKdoločeni meri.To ni edini standard za identifikacijo izkoristka in čistosti nukleinske kisline, uporablja se le kot referenca in ni "zlati standard".

Priročnik Thermo Fisher ND-2000 poudarja zanesljivost rezultatov testa

Razlog je v tem, da rezultati, dobljeni z uporabo mikro/ultramikro UV spektrofotometra, odražajo le izkoristek in čistost nukleinske kisline s strani in obstaja veliko dejavnikov vpliva (optična pot, volumen vzorca, koncentracija vzorca, pH vrednost, drugi ioni, ki vplivajo na merjenje absorbance itd.), izmerjena vrednost OD ni nujno točna.Hkrati imajo zaradi pomanjkanja specifičnosti materiala za določanje vrednosti absorbance enoverižna DNA, dvoverižna DNA, RNA, dNTP in nekateri proteini vsi absorpcijski vrhovi pri valovni dolžini 260 nm in koncentracija, ki jo določi sam A260, ni nujno prava DNA ali RNA.Koncentracije ter njene celovitosti in degradacije ni mogoče oceniti.

Kako torej oceniti kakovost naše prečiščene nukleinske kisline?Poleg uporabe mikro/ultramikro UV spektrofotometra za odkrivanje so potrebne tudi metode, kot je elektroforeza v agaroznem gelu, da se vizualno prikaže čistost in celovitost nukleinske kisline ter da se do določene mere prikaže koncentracija.Na ta način sta izkoristek in čistost nukleinske kisline, dobljena iz rezultatov detekcije različnih metod, verodostojna.

Eksperimentalna primerjava grafikonov

Genomsko DNK celic H1299 smo ekstrahirali z uporabo kompletov za ekstrakcijo DNK podjetja A in opazili smo znatno onesnaženje z nečistočami, kar je povzročilo visoke vrednosti OD

(izmerjena vrednost OD in ustrezen elektroferogram)

Indeks ocenjevanja

Ali obstaja "zlati standard" za testiranje izkoristka nukleinske kisline in kakovosti?

Kolikor vemo, enostavne, hitre in poceni metode ni.Ne glede na to, ali gre za spektrofotometer, gelsko elektroforezo ali masno spektrometrijo, vse odražajo koncentracijo in čistost nukleinske kisline v raztopini z različnih vidikov in jih je treba presojati med seboj.

Najboljši indeks ocene je vednonadaljnjo eksperimentalno uporabo.Ne vpliva na učinkovitost reverzne transkripcije in pomnoževanja PCR.Pridobivanje zanesljivih produktov pomnoževanja in vrednosti Ct ter pridobivanje celotnega zaporedja s sekvenciranjem je uspešna ekstrakcija nukleinske kisline.

Če povzamem, pogled na teorijo samo razmerja bi moral biti izpodbijan s stališčem "uporabe dobrih nadaljnjih eksperimentalnih rezultatov kot dobrih parametrov ekstrakcije"!

Priporočeni kompleti Foregene DNA za ekstrakcijo RNA za visoko čistost DNA/RNA:

https://www.foreivd.com/reagent/dna-isolation-series/

https://www.foreivd.com/reagent/rna-isolation-series/