PCR je najpogosteje uporabljena tehnologija pomnoževanja nukleinske kisline in se pogosto uporablja zaradi svoje občutljivosti in specifičnosti.Vendar pa PCR zahteva ponavljajočo se toplotno denaturacijo in se ne more znebiti omejitev zanašanja na instrumente in opremo, kar omejuje njegovo uporabo pri kliničnem testiranju na terenu.

Od začetka devetdesetih let prejšnjega stoletja so številni laboratoriji začeli razvijati tehnologijo ojačanja s konstantno temperaturo, ki ne zahteva toplotne denaturacije.Zdaj so razvili tehnologijo izotermnega pomnoževanja, posredovanega z zanko, tehnologijo izotermnega pomnoževanja z nadomestno verigo, tehnologijo izotermnega pomnoževanja z valjčnim krogom in odvisnost od zaporedja nukleinske kisline.Tehnologija izotermnega ojačanja in druge tehnologije. 

Loop posredovano izotermno ojačanje

Načelo pomnoževanja temelji na dejstvu, da je DNK v dinamičnem ravnotežnem stanju pri približno 65 °C.Ko je katerikoli primer bazno seznanjen in razširjen na komplementarni del dvoverižne DNA, bo druga veriga disociirala in postala enoverižna.

Pri tej temperaturi DNK uporablja 4 specifične primerje, ki se zanašajo na polimerazo DNA s premestitvijo verige, da omogoči neprekinjeno samokroženje sinteze DNA s premestitvijo verige.

Najprej določite 6 specifičnih regij F3, F2, F1, B1, B2, B3 na ciljnem genu in nato oblikujte 4 primerje na podlagi teh 6 specifičnih regij (kot je prikazano na spodnji sliki):

Prednji notranji primer (FIP) je sestavljen iz F1c in F2.

Povratni notranji primer (BIP) je sestavljen iz B1c in B2, TTTT pa se uporablja kot distančnik na sredini.

Zunanja primerja F3 oziroma B3 sta sestavljena iz regij F3 oziroma B3 na ciljnem genu.

V reakcijskem sistemu LAMP je koncentracija notranjega primerja nekajkrat večja od koncentracije zunanjega primerja.Notranji primer se najprej združi z vzorčno verigo, da se sintetizira komplementarna veriga, da se tvori dvojna veriga DNA.Nato se zunanji primer kombinira z vzorčno verigo, da se tvori dvojna veriga DNA.Pod delovanjem polimeraze BstDNA se sprosti komplementarna veriga, ki jo sintetizira notranji primer.Po nizu reakcij komplementarna veriga končno tvori eno samo verigo DNK s strukturo dumbbell.

Sama ena veriga DNK s strukturo dumbbell se uporablja kot predloga za neprekinjeno oblikovanje prehodne DNK s strukturo stebla in zanke z odprtim koncem.Notranji in zunanji primerji usmerjajo prehodno strukturo stebla-zanke DNK, da je neprekinjeno podvržena reakcijam premika in podaljševanja verige ter na koncu tvori več struktur stebla-zanke z različnimi dolžinami.mešanica DNK.

Prednosti in slabosti izotermnega ojačanja, posredovanega z zanko

Prednosti LAMP:

(1) Visoka učinkovitost pomnoževanja, ki lahko učinkovito pomnoži 1-10 kopij ciljnega gena v 1 uri, učinkovitost pomnoževanja pa je 10-100-krat večja od običajne PCR.

(2) Reakcijski čas je kratek, specifičnost je močna in posebna oprema ni potrebna.

Slabosti LAMP:

(1) Zahteve za temeljne premaze so še posebej visoke.

(2) Pomnoženega produkta ni mogoče uporabiti za kloniranje in sekvenciranje, ampak ga je mogoče uporabiti samo za presojo.

(3) Zaradi njegove močne občutljivosti je enostavno oblikovati aerosole, kar povzroči lažno pozitivne rezultate in vpliva na rezultate testa.

Sojačanje trand displacement

Pomnoževanje s premikom verige (SDA) je tehnika izotermnega pomnoževanja DNK in vitro, ki temelji na encimski reakciji, ki jo je prvi predlagal ameriški učenjak Walker leta 1992.

Osnovni sistem SDA vključuje restrikcijsko endonukleazo, DNA polimerazo z aktivnostjo premikanja verige, dva para primerjev, dNTP ter kalcijeve in magnezijeve ione ter pufrske sisteme.

Načelo pomnoževanja s premikom verige temelji na kemično spremenjenem zaporedju prepoznavanja restrikcijske endonukleaze na obeh koncih tarčne DNA.Endonukleaza odpre vrzel v verigi DNA na njenem prepoznavnem mestu, DNA polimeraza pa razširi vrzel 3′ End in nadomesti naslednjo verigo DNA.

Zamenjane enojne verige DNA je mogoče kombinirati s primerji in jih z DNA polimerazo razširiti v dvojne verige.Ta postopek se nenehno ponavlja, tako da se ciljno zaporedje učinkovito ojača.

Prednosti in slabosti tehnologije ojačanja s premikom pramenov

Prednosti SDA:

Učinkovitost ojačanja je visoka, reakcijski čas kratek, specifičnost močna in posebna oprema ni potrebna.

Slabosti SDA:

Produkti niso enakomerni in nekateri enoverižni in dvoverižni izdelki se vedno proizvedejo v ciklu SDA, zato se neizogibno pojavi rep, ko ga zazna elektroforeza.

Rojačanje olling kroga

Pomnoževanje kotalnega kroga (RCA) je predlagano na podlagi metode kopiranja DNK iz patogenih organizmov z valjčnim krogom.Nanaša se na uporabo enoverižne krožne DNK kot predloge pri konstantni temperaturi in posebne DNK polimeraze (kot je Phi29) ) Pod delovanjem kotalnega kroga sinteze DNK, da se doseže pomnoževanje ciljnega gena.

RCA lahko razdelimo na linearno ojačanje in eksponentno ojačanje.Učinkovitost linearnega RCA lahko doseže 10⁵krat, učinkovitost eksponentnega RCA pa lahko doseže 10⁹krat.

Preprosto razlikovanje, kot je prikazano na spodnji sliki, linearno pomnoževanje a uporablja samo 1 primer, eksponentno pomnoževanje b pa 2 primerja.

Linearni RCA se imenuje tudi enojni primer RCA.Primer se veže na krožno DNA in se podaljša z delovanjem DNA polimeraze.Izdelek je linearna enojna nit z velikim številom ponavljajočih se zaporedij, tisočkrat daljših od ene same zanke.

Ker je produkt linearnega RCA vedno povezan z začetnim primerkom, je enostavna fiksacija signala velika prednost.

Eksponentna RCA, znana tudi kot hiperrazvejana amplifikacija HRCA (Hyperbranded RCA), pri eksponentni RCA en primer pomnoži produkt RCA, drugi primer hibridizira s produktom RCA in se razširi, zamenjava pa je že vezana na produkt RCA. Primerji na nižji stopnji razširijo verigo ter ponovijo razširitev in zamenjavo, da nastane dendritični produkt pomnoževanja RCA.

Prednosti in slabosti pomnoževanja nukleinske kisline v krogu

Prednosti RCA:

Visoka občutljivost, dobra specifičnost in enostavno upravljanje.

Slabosti RCA:

Težave v ozadju med zaznavanjem signala.Med reakcijo RCA lahko neobkrožena sonda ključavnice in vzorčna DNK ali RNK nevezane sonde ustvarita nekaj signalov v ozadju. 

Npomnoževanje na osnovi zaporedja ukleinske kisline

Pomnoževanje na osnovi zaporedja nukleinskih kislin (NASBA) je nova tehnologija, razvita na osnovi PCR.Gre za kontinuirano in izotermno pomnoževanje nukleinske kisline, ki ga vodi par primerjev s promotorsko sekvenco T7.Tehnologija lahko pomnoži šablonsko RNK za približno 109-krat v približno 2 urah, kar je 1000-krat več kot običajna metoda PCR in ne zahteva posebne opreme.

Ta tehnologija je bila uporabljena za hitro diagnosticiranje bolezni, takoj ko se je pojavila, in številna podjetja trenutno uporabljajo to metodo v kompletih za odkrivanje RNK.

Čeprav lahko pomnoževanje RNA uporablja tudi tehnologijo PCR z reverzno transkripcijo, ima NASBA svoje prednosti: izvaja se lahko pri razmeroma konstantnih temperaturnih pogojih in je stabilnejša in natančnejša od tradicionalne tehnologije PCR.

Reakcija poteka pri 41 stopinjah Celzija in za dokončanje zahteva reverzno transkriptazo AMV (virus ptičje mieloblastoze), RNazo H, T7 RNA polimerazo in par primerjev.

Postopek vključuje predvsem:

Predhodni primer vsebuje komplementarno zaporedje promotorja T7.Med reakcijo se začetni primer veže na verigo RNA in ga katalizira encim AMV, da nastane dvojna veriga DNA-RNA.

RNaza H prebavi RNA v hibridni dvojni verigi in obdrži enoverižno DNA.

Pod delovanjem reverznega primerja in encima AMV nastane dvojna veriga DNA, ki vsebuje zaporedje promotorja T7.

Pod delovanjem polimeraze T7 RNA se proces prepisovanja zaključi in nastane velika količina ciljne RNA.

Prednosti NASBA:

(1) Njegov primer ima zaporedje promotorja T7, tuja dvoverižna DNA pa nima zaporedja promotorja T7 in ga ni mogoče pomnožiti, zato ima ta tehnologija visoko specifičnost in občutljivost.

(2) NASBA neposredno vključi proces reverzne transkripcije v reakcijo pomnoževanja in tako skrajša reakcijski čas.

Slabosti NASBA:

(1) Reakcijske komponente so bolj zapletene.

(2) Za višje stroške reakcije so potrebne tri vrste encimov.