PCR, večkraten PCR, PCR in situ, Povratni PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Razvrstili bomo koncepte, korake in podrobnosti različnih PCR

Ⅰ. PCR

Verižna reakcija s polimerazo, imenovana PCR, je molekularna biološka tehnologija, ki se uporablja za povečanje specifičnih fragmentov DNA.Lahko se obravnava kot posebna replikacija DNK in vitro.DNA polimeraza (DNA polimeraza I) je bila odkrita že leta 1955, Klenow fragment E. Coli, ki ima eksperimentalno vrednost in uporabnost, pa je odkril dr. H. Klenow v zgodnjih sedemdesetih letih prejšnjega stoletja, a ker ta encim ne prenaša temperature, ga lahko visoka temperatura degenerira, zato ne ustreza verižni reakciji polimeraze z degeneracijo pri visoki temperaturi.Encimi, ki se danes uporabljajo (imenovani Taq polimeraza), so bili izolirani iz Thermus aquaticus, vroče izvirske bakterije leta 1976. Njena značilnost je, da je odporen na visoke temperature in je idealen encim, vendar se pogosto uporablja po osemdesetih letih prejšnjega stoletja.Izvirni koncept izvirnega primitivnega prototipa PCR je podoben popravljanju in kopiranju genov, ki ga je predlagal dr. KJell Kleppe leta 1971. Objavil je prvo preprosto in kratkotrajno kopijo gena (podobno reakcijam prvih dveh ciklov PCR).Danes razviti PCR je razvil dr. Kary B. Mullis leta 1983. Dr. Mullis je tisto leto služil PE podjetjem, zato ima PE poseben status v industriji PCR.Dr. Mullis je uradno objavil prvi sorodni članek s Saikijem in drugimi leta 1985. Od takrat je uporaba PCR na tisoče kilometrov na dan in zaradi kakovosti sorodnih člankov lahko rečemo, da so številne druge raziskovalne metode neprimerne.Kasneje se tehnologija PCR široko uporablja v bioloških znanstvenih raziskavah in kliničnih aplikacijah ter je postala najpomembnejša tehnologija raziskav molekularne biologije.Mullis je leta 1993 prejel tudi Nobelovo nagrado za kemijo.

PCRNačelo

Osnovni princip tehnologije PCR je podoben naravnemu procesu replikacije DNA, njegova specifičnost pa je odvisna od oligonukleotidnega primerja, ki je komplementaren obema koncema ciljnega zaporedja.PCR je sestavljen iz treh osnovnih reakcijskih korakov degeneracije-žarjenja-podaljšanja: ①Degeneracija šablonske DNK: Ko se šablonska DNK nekaj časa segreje na približno 93 °C, se raztopina dvojne DNK za dvojno verižno DNK, ki nastane s PCR pomnoževanjem šablonske DNK, zapusti, naredi enojno verigo, tako da jo je mogoče kombinirati s primerjem za pripravo na naslednji krog reakcije.②Žarjenje (spojina) matrične DNK in primerja: Ko se matrična DNK segreje in degenerira v eno verigo, temperatura pade na približno 55 °C.Komplementarno zaporedje začetnika in enoverižne DNA predloge.③Razširitev primerja: šablona DNA - vezava primerja temelji na delovanju TaqDNA polimeraze, z dNTP kot reakcijsko surovino.Ohranite načelo replikacije, sintetizirajte novo polrezervirano kopirno verigo, ki dopolnjuje šablonsko verigo DNK, in ponovite cikel degeneracija-žarjenje-podaljšanje treh procesov, lahko dobite več "polrezervirane kopijne verige" in ta nova veriga je spet na voljo. Postanite predloga za naslednji cikel.Za dokončanje zanke traja 2-4 minute, ciljni gen se lahko pomnoži več milijonov krat v 2-3 urah.

StandardnoPCRReakcijski sistem

Pet elementov reakcije PCR

Pri PCR reakciji sodeluje predvsem pet vrst snovi, in sicer primer, encim, dNTP, matrica in pufer (potreben je Mg2+).[Postopek PCR]

Standardni postopek PCR je razdeljen na tri korake

1. Degeneracija DNK (90°C-96°C): dvoverižne DNK predloge pod termičnim delovanjem, vodikove vezi se pretrgajo in tvorijo enoverižno DNK.

2. Žarjenje (25 ℃ -65 ℃): Sistemska temperatura se zniža, primer se kombinira s šablono DNK, da se tvori lokalna dvojna veriga.

3. Podaljšanje (70 ℃ -75 ℃): Pod delovanjem encima Taq (približno 72 °C, najboljša aktivnost) se dNTP uporablja kot surovina, razteza se od 5′ konca primerja → 3′ konca, sinteza in predloga se medsebojno dopolnjujeta verigi DNA.

Vsak cikel je denaturiran, žarjen in podaljšan, kar podvoji vsebnost DNK.Trenutno je zaradi kratkega območja pomnoževanja mogoče nekaj PCR ponoviti v zelo kratkem času, tudi če aktivnost encima Taq ni optimalna, zato ga je mogoče spremeniti v dva koraka, to je, da se lahko žarjenje in podaljšanje izvedeta pri 60 °C-65 °C hkrati.Da bi zmanjšali proces dvigovanja in hlajenja ter izboljšali odzivno hitrost.

Značilnosti reakcije PCR

● Visoka specifičnost

Posebni odločilni dejavniki odziva PCR so: ①Specifična kombinacija primerja in vzorčne DNK.②Načelo združevanja baz.③Zvestoba reakcije sinteze polimeraze TaqDNA.④Specifičnost in konzervativnost ciljnega gena.

Pravilna kombinacija primerjev in predlog je ključna.Vezava primerja in šablone ter podaljševanje verige primerja temelji na principu ujemanja alkalnih baz.Zvestoba reakcij sinteze polimeraze in visokotemperaturna odpornost Taq DNA polimeraze za izdelavo vezave (spojine) predloge in primerja v reakciji se lahko izvede pri višji temperaturi.Specifičnost kombinacije se močno poveča.Sponka lahko ohrani visoko stopnjo pravilnosti.Z izbiro ciljne genetske regije z visoko konservativnostjo in visoko konservativnostjo je njena specifičnost večja.

● Visoka občutljivost

Obseg proizvodnje produktov PCR se poveča z indeksom, ki lahko razširi začetno predlogo Pickerja (PG=10-12), da poveča raven mikrokrmilnika na raven mikrogramov (μg= -6).Ciljne celice je mogoče zaznati iz 1 milijona celic;pri odkrivanju virusov lahko občutljivost PCR doseže 3 RFU (prazne točke oblikovane enote);najmanjša stopnja odkrivanja v bakterijski znanosti je 3 bakterije.

● Enostavno in hitro

Odboj PCR uporablja visokotemperaturno polimerazo Taq DNA, ki naenkrat doda reakcijsko raztopino, to je reakcijo degeneracije-žarjenja-podaljšanja na raztopini za pomnoževanje DNA in loncu z vodno kopeljo.Na splošno je reakcija ojačanja končana v 2 do 4 urah.Razširjeni izdelki se na splošno analizirajo z električnim mečem in jim ni treba uporabljati izotopov, brez radioaktivnega onesnaženja in enostavne promocije.

● Čistost vzorca je nizka

Ni potrebe po ločevanju virusov ali bakterij in gojenih celic.Surovi produkti DNK in RNK se lahko uporabljajo kot ojačevalci.Zaznavanje pomnoževanja DNK je mogoče uporabiti neposredno z uporabo kliničnih vzorcev, kot so kri, telesna tekočina, tekočina za izpiranje kašlja, lasje, celice in živo tkivo.

PCRpogoste težave

● Lažno negativen, brez ojačanih pasov

Ključne faze reakcije PCR vključujejo: ① pripravo vzorčnih nukleinskih kislin, ② kakovost in specifičnost primerjev, ③ kakovost encimov, ④ pogoje cikla PCR.Iskanje razloga je treba analizirati in preučiti tudi za zgornje povezave.

Šablone: ​​① Šablona vsebuje različne beljakovine, ② Šablona vsebuje zaviralec encima Taq, ③ Protein v šabloni ni odstranjen, zlasti protein skupine v kromosomu.⑤ Deminerjeva degeneracija nukleinske kisline ni temeljita.Ko je kakovost encimov in primerjev dobra, ni traku pomnoževanja, kar je najverjetneje posledica prebavne obdelave vzorcev.Nekaj ​​je narobe s postopkom ekstrakcije nukleinske kisline s predlogo, zato je treba za pripravo učinkovite in stabilne raztopine za prebavo njen postopek določiti in ne samovoljno spreminjati.

Inaktivacija encima: nov encim ali stare in nove encime je treba uporabiti skupaj za analizo, ali je aktivnost encima izgubljena ali nezadostna, kar vodi do lažno negativnih rezultatov.Opozoriti je treba, da se na encim Taq ali etidijev bromid včasih pozabi.

Primer: kakovost temeljnega premaza, koncentracija primerja in ali je koncentracija obeh primerjev simetrična.To je pogost razlog za neuspeh PCR ali naraščajoči pas ni idealen in je nagnjen k razpršenju.Obstajajo težave s kakovostjo temeljnih premazov nekaterih serijskih številk.Oba primerja imata visoko in nizko koncentracijo, kar povzroča nizko učinkovito asimetrično pomnoževanje.Protiukrepi so: ① Izberite dober primer za sintezo enot.② Koncentracija primerja ni odvisna le od vrednosti OD, ampak je pozorna tudi na prvotno tekočino primerja za elektroforezo v agar sladkornem gelu.Obstajati mora območje traku temeljnega premaza, svetlost obeh temeljnih premazov pa mora biti na splošno enaka.Belt, PCR morda trenutno ne uspe, zato ga je treba rešiti z enoto za sintezo primerja.Če je temeljni premaz visok, je svetlost nizka in njegova koncentracija mora biti pri redčenju uravnotežena.③ Primer je treba plačati in hraniti pri visoki koncentraciji, da se prepreči večkratno zamrzovanje ali dolgotrajno hlajenje delov hladilnika, kar bo povzročilo poslabšanje in razgradnjo temeljnega premaza.④ Zasnova temeljnega premaza je nerazumna, na primer dolžina temeljnega premaza je nezadostna in med temeljnima premazoma nastane di grozd.

Koncentracija Mg2+: koncentracija ionov Mg2+ ima velik vpliv na učinkovitost PCR pomnoževanja.Prekomerna koncentracija lahko zmanjša PCR pomnoževanje nasprotnega spola.Če je koncentracija prenizka, bo izhod pomnoževanja PCR celo povzročil neuspeh pomnoževanja PCR brez razširitvenega pasu.

Sprememba reakcijskega volumna: Volumen, uporabljen pri pomnoževanju PCR, je 20 ul, 30 ul in 50 ul ali 100 uL, velik volumen aplikacije za pomnoževanje PCR je nastavljen glede na različne namene znanstvenih raziskav in kliničnega testiranja.Po izdelavi majhnih volumnov, kot je 20 ul, je treba pri izdelavi velikosti zagotoviti stanje vrvice, sicer ne bo uspelo.

Fizični razlogi: Transformacija je zelo pomembna za PCR pomnoževanje.Če je temperatura degeneracije nizka, je čas degeneracije kratek, verjetno bo prišlo do lažno negativnih rezultatov;prenizka temperatura žarjenja lahko povzroči nespecifično ojačanje in zmanjša učinkovitost specifičnega ojačanja.Močno vpliva na kombinacijo primerjev in predlog za zmanjšanje učinkovitosti pomnoževanja PCR.Včasih je treba uporabiti standardne termometre za zaznavanje variabilnosti, žarjenja in podaljšane temperature v podaljšku ali vodotopnem kuhalniku, kar je eden od razlogov za neuspeh PCR.

Različice ciljnega zaporedja: Če pride do ciljnega zaporedja, mutacije ali delecije, kombinacije prototipa in predloge se združi ali zaradi pomanjkanja ciljnega zaporedja, bosta primer in predloga izgubila komplementarno zaporedje in njegovo PCR pomnoževanje ne bo uspešno.

● Lažno pozitivno

Pas pomnoževanja PCR je videti skladen s pasom ciljnega zaporedja, včasih pa je njegov pas bolj čist in višji.

Zasnova primerja ni primerna: izbrano pomnoževalno zaporedje in nenamensko pomnoževalno zaporedje sta homologni, zato so pri pomnoževanju PCR pomnoženi produkti PCR nenamenska zaporedja.Ciljno zaporedje je prekratko ali primer prekratek in je nagnjen k lažno pozitivnim rezultatom.Treba ga je preoblikovati.

Navzkrižno onesnaženje ciljnega zaporedja ali produktov pomnoževanja: Obstajata dva razloga za to onesnaženje: Prvič, navzkrižno onesnaženje celotnega genoma ali velikih segmentov, kar povzroči lažno pozitivne rezultate.To vrsto lažno pozitivnih rezultatov je mogoče rešiti z naslednjimi metodami: Bodite previdni in nežni med delovanjem, da preprečite vdihovanje ciljnega zaporedja v pištolo za vzorec ali brizganje iz centrifugalne cevi.Razen encimov in snovi, ki ne prenesejo visokih temperatur, je treba vse reagente ali opremo razkužiti z visokim pritiskom.Centrifugalne cevi in ​​vzorce je treba uporabiti hkrati.Po potrebi se pred dodajanjem vzorcev reakcijska epruveta in reagent izpostavita ultravijoličnim žarkom, da se uniči obstoječa nukleinska kislina.Drugič, majhni delci onesnaženega zraka.Ti majhni fragmenti so krajši od ciljnega zaporedja, vendar imajo določeno homologijo.Lahko se med seboj spaja.Po dopolnitvi primerjev se lahko produkt PCR razširi, kar bo povzročilo lažno pozitivno proizvodnjo.Uporablja se lahko za zmanjšanje ali odpravo metode nest PCR.

● Pojavi se nespecifični ojačitveni pas

Trakovi, ki so se pojavili po PCR pomnoževanju, niso v skladu s pričakovano velikostjo ali so veliki ali majhni, ali istočasno ali istočasno specifični pasovi pomnoževanja in nespecifični pasovi pomnoževanja.Pojav nespecifičnih trakov je: Prvič, primerji so nepopolno komplementarni ciljnemu zaporedju ali polimerizacija primerja, da se tvori di grozd.Drugi je, da je koncentracija MG2+ionov previsoka, temperatura žarjenja je prenizka in je povezano število ciklov PCR.Drugič, kakovost in količina encimov.Pogosto so encimi nekaterih virov nagnjeni k ne-posebnim pasovom, encimi drugega vira pa se ne pojavijo.Včasih pride tudi do nespecifičnega pomnoževanja encimov.Protiukrepi so: po potrebi preoblikovano privlačno.Zmanjšajte količino encima ali zamenjajte encim drugega vira.Zmanjšajte količino primarnih, ustrezno povečajte količino predlog in zmanjšajte število ciklov.Ustrezno zvišajte temperaturo žarjenja ali uporabite metodo dveh temperaturnih točk (degeneracija 93 °C, žarjenje in podaljšanje pri približno 65 °C).

● Videti luskasto predivo ali razmazati trak

PCR pomnoževanje se včasih zdi, kot da je nanesen ali oluščen ali preprogi podoben pas.Zaradi prevelike količine encimov ali slabe kakovosti encima je koncentracija dNTP previsoka, koncentracija Mg2+ previsoka, temperatura žarjenja prenizka in število ciklov preveliko.Protiukrepi so: ①Zmanjšajte količino encimov ali zamenjajte encim drugega vira.②Zmanjšajte koncentracijo dNTP ③Ustrezno zmanjšajte koncentracijo Mg2+.④ Povečajte količino predlog in zmanjšajte število ciklov.

Podobni izdelki

PCR Heroᵀᴹ (z barvilom)

◮ Večja zvestoba: 6-krat večja od navadnega encima Taq;

◮ Večja hitrost ojačanja

◮ Večja prilagodljivost predloge

◮ Večja učinkovitost ojačanja

◮ Okoljska toleranca je močnejša: postavljena na 37 °C za en teden, ohranja več kot 90 % aktivnosti;

◮ Ima 5'→3' DNA polimerazno aktivnost in 5'→3' eksonukleazno aktivnost, brez 3'→5' eksonukleazne aktivnosti.

PCR Easyᵀᴹ (z barvilom)

Edinstven reakcijski sistem in visoko učinkovita Taq DNA polimeraza omogočata, da ima reakcija PCR večjo učinkovitost pomnoževanja, specifičnost in občutljivost.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Komplet v enem koraku omogoča reverzno transkripcijo in qPCR dve reakciji v isti epruveti, dodati je treba samo šablonsko RNA, specifične primerje PCR in ddH brez RNaze₂O.

◮ Komplet lahko hitro in učinkovito kvantitativno analizira virusno RNK ali RNK v sledovih.

◮ Komplet uporablja edinstven reagent za reverzno transkripcijo Foregene in DNA polimerazo Foregene HotStar Taq v kombinaciji z edinstvenim reakcijskim sistemom za učinkovito izboljšanje učinkovitosti pomnoževanja in specifičnosti reakcije.

◮ Optimiziran reakcijski sistem omogoča, da ima reakcija večjo občutljivost zaznavanja, močnejšo toplotno stabilnost in boljšo toleranco.

◮ RT-qPCR Enostavno^TMKomplet (One Step)-SYBR Green I je opremljen z notranjim referenčnim barvilom ROX, ki ga je mogoče uporabiti za odpravo ozadja signala in napak signala med vdolbinicami, kar je uporabnikom priročno za uporabo v različnih modelih kvantitativnih instrumentov PCR.

RT Enostavno^TMII (Glavna predmešanica za sinteza prve verige cDNA zaPCR v realnem času)

-Učinkovita sposobnost odstranjevanja gDNA, ki lahko odstrani gDNA v predlogi v 2 minutah.

-Učinkovit sistem reverzne transkripcije, potrebuje le 15 minut za dokončanje sinteze prve verige cDNA.

- Kompleksne predloge: predloge z visoko vsebnostjo GC in kompleksno sekundarno strukturo je mogoče tudi obrniti z visoko učinkovitostjo.

- Visoko občutljiv sistem povratne transkripcije, predloge na ravni pg lahko pridobijo tudi visoko kakovostno cDNA.

-Sistem reverzne transkripcije ima visoko toplotno stabilnost, optimalna reakcijska temperatura je 42 ℃ in ima še vedno dobro delovanje reverzne transkripcije pri 50 ℃.