PCR (verižna reakcija s polimerazo) je ena od in vitro tehnologij za pomnoževanje DNK z več kot 30-letno zgodovino.

Tehnologijo PCR je leta 1983 uvedel Kary Mullis iz Cetusa v ZDA. Mullis je leta 1985 zaprosil za patent PCR in istega leta objavil prvi akademski članek PCR o znanosti.Mullis je za svoje delo leta 1993 prejel Nobelovo nagrado za kemijo.

Osnovna načela PCR

PCR lahko pomnoži ciljne fragmente DNK za več kot milijonkrat.Načelo je pod katalizo DNA polimeraze, pri čemer se kot matrica uporablja matična veriga DNA in specifičen primer kot izhodišče za razširitev.Replicira se in vitro s koraki, kot so denaturacija, žarjenje in podaljšanje.Proces hčerinske verige DNK, ki je komplementarna matični DNK matične verige.

Standardni postopek PCR je razdeljen na tri korake:

1. Denaturacija: uporabite visoko temperaturo za ločevanje dvojnih verig DNK.Vodikova vez med dvojnimi verigami DNA se prekine pri visoki temperaturi (93-98 ℃).

2. Žarjenje: Ko je dvoverižna DNK ločena, znižajte temperaturo, da se primer lahko veže na enoverižno DNK.

3. Podaljšanje: DNK polimeraza začne sintetizirati komplementarne verige vzdolž verig DNK iz vezanih primerjev, ko se temperatura zniža.Ko je podaljšek končan, je cikel sklenjen in število fragmentov DNK se podvoji

Če te tri korake ponovite 25- do 35-krat, se bo število fragmentov DNK eksponentno povečalo.

Iznajdljivost PCR je v tem, da je mogoče oblikovati različne primerje za različne ciljne gene, tako da je mogoče fragmente ciljnih genov pomnožiti v kratkem času.

Do sedaj lahko PCR razdelimo v tri kategorije, in sicer navadni PCR, fluorescentni kvantitativni PCR in digitalni PCR.

Prva generacija navadnega PCR

Uporabite navaden instrument za pomnoževanje PCR za pomnoževanje ciljnega gena in nato z elektroforezo v agaroznem gelu zaznajte produkt, opravite lahko samo kvalitativno analizo.

Glavne slabosti prve generacije PCR:

1. Nagnjenost k nespecifičnemu ojačanju in lažno pozitivnim rezultatom.

2. Odkrivanje traja dolgo in operacija je okorna.

3. Izvede se lahko samo kvalitativni test

Druga generacija PCR v realnem času

PCR v realnem času, znan tudi kot qPCR, uporablja fluorescentne sonde, ki lahko kažejo napredek reakcijskega sistema, in spremlja kopičenje pomnoženih produktov s kopičenjem fluorescenčnih signalov ter ocenjuje rezultate s pomočjo krivulje fluorescence.Kvantificiramo ga lahko s pomočjo vrednosti Cq in standardne krivulje.

Ker se tehnologija qPCR izvaja v zaprtem sistemu, je verjetnost kontaminacije zmanjšana, fluorescenčni signal pa je mogoče spremljati za kvantitativno detekcijo, zato je najbolj razširjena v klinični praksi in je postala prevladujoča tehnologija v PCR.

Fluorescentne snovi, ki se uporabljajo pri fluorescentni kvantitativni PCR v realnem času, lahko razdelimo na: fluorescenčno sondo TaqMan, molekularne svetilnike in fluorescentno barvilo.

1) TaqMan fluorescentna sonda:

Med pomnoževanjem PCR se doda posebna fluorescentna sonda, hkrati pa se doda par primerjev.Sonda je oligonukleotid in oba konca sta označena z reportersko fluorescenčno skupino in dušilno fluorescentno skupino.

Ko je sonda nedotaknjena, fluorescentni signal, ki ga oddaja reporterska skupina, absorbira dušilna skupina;med pomnoževanjem PCR eksonukleazna aktivnost 5'-3' encima Taq cepi in razgradi sondo, zaradi česar sta reporterska fluorescenčna skupina in dušilec. Fluorescentna skupina je ločena, tako da lahko sistem za spremljanje fluorescence sprejme fluorescenčni signal, kar pomeni, da vsakič, ko se veriga DNA pomnoži, nastane fluorescenčna molekula in kopičenje fluorescenčnega signala popolnoma sinhroniziran s tvorbo produkta PCR.

2) Fluorescentno barvilo SYBR:

V reakcijskem sistemu PCR je dodan presežek fluorescentnega barvila SYBR.Ko je fluorescentno barvilo SYBR nespecifično vključeno v dvojno verigo DNA, oddaja fluorescentni signal.Molekula barvila SYBR, ki ni vključena v verigo, ne bo oddajala nobenega fluorescentnega signala, s čimer bo zagotovljen fluorescenčni signal Povečanje produktov PCR je popolnoma sinhronizirano s povečanjem produktov PCR.SYBR se veže le na dvoverižno DNA, zato se lahko s krivuljo taljenja ugotovi, ali je reakcija PCR specifična.

3) Molekularni svetilnik:

Je dvojno označena oligonukleotidna sonda s steblom zanke, ki tvori lasno strukturo približno 8 baz na 5 in 3 koncu.Sekvence nukleinske kisline na obeh koncih so komplementarno seznanjene, zaradi česar sta fluorescenčna skupina in skupina za dušenje tesni.Zaprite, fluorescenca ne bo nastala.

Ko je produkt PCR ustvarjen, se med postopkom žarjenja srednji del molekularnega svetilnika poveže s specifičnim zaporedjem DNK in fluorescenčni gen se loči od dušilnega gena, da proizvede fluorescenco.

Glavne slabosti PCR druge generacije:

Občutljivost je še vedno pomanjkljiva, zaznavanje primerkov z nizko kopijo pa je netočno.

Prisoten je vpliv vrednosti ozadja, rezultat pa je dovzeten za motnje.

Če so v reakcijskem sistemu zaviralci PCR, so rezultati detekcije dovzetni za motnje.

Digitalni PCR tretje generacije

Digitalni PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) izračuna število kopij ciljnega zaporedja z zaznavanjem končne točke in lahko izvede natančno absolutno kvantitativno zaznavanje brez uporabe notranjih kontrol in standardnih krivulj.

Digitalni PCR uporablja detekcijo končne točke in ni odvisen od vrednosti Ct (prag cikla), zato učinkovitost pomnoževanja manj vpliva na reakcijo digitalne PCR, toleranca na zaviralce reakcije PCR pa je izboljšana z visoko natančnostjo in ponovljivostjo.

Zaradi lastnosti visoke občutljivosti in visoke natančnosti ga zaviralci reakcije PCR ne motijo ​​zlahka in lahko doseže resnično absolutno kvantifikacijo brez standardnih produktov, ki so postali žarišče raziskav in uporabe.

Glede na različne oblike reakcijske enote jo lahko razdelimo na tri glavne vrste: mikrofluidne, čipne in kapljične sisteme.

1) Mikrofluidni digitalni PCR, mdPCR:

Na podlagi mikrofluidne tehnologije se DNK predloga loči.Mikrofluidna tehnologija lahko realizira nano-nadgradnjo vzorca ali ustvarjanje manjših kapljic, vendar kapljice potrebujejo posebno adsorpcijsko metodo in nato kombinirane z reakcijskim sistemom PCR.mdPCR so postopoma prevzele druge metode.

2) Digitalni PCR na osnovi kapljic, ddPCR:

Uporabite tehnologijo generiranja kapljic vode v olju za obdelavo vzorca v kapljice in razdelite reakcijski sistem, ki vsebuje molekule nukleinske kisline, na tisoče kapljic v nanometru, od katerih vsaka ne vsebuje ciljne molekule nukleinske kisline, ki jo je treba zaznati, ali vsebuje eno do več ciljnih molekul nukleinske kisline, ki jih je treba testirati.

3) Digitalni PCR na osnovi čipa, cdPCR:

Uporabite tehnologijo integrirane tekočinske poti za graviranje številnih mikrocevk in mikrovotlin na silicijeve rezine ali kremenčevo steklo ter nadzor pretoka raztopine skozi različne kontrolne ventile in razdelitev tekočine vzorca na nanometre enake velikosti v reakcijske vdolbinice za digitalno reakcijo PCR, da dosežete absolutno kvantifikacijo.

Glavne slabosti PCR tretje generacije:

Oprema in reagenti so dragi.

Zahteve glede kakovosti predloge so visoke.Če količina predloge presega količino mikrosistema, je ne bo mogoče kvantificirati, če pa je premajhna, bo točnost kvantifikacije zmanjšana.

Lažno pozitivni rezultati se lahko ustvarijo tudi, če gre za nespecifično ojačanje.