COVID-19 je nalezljiva bolezen, ki jo povzroča koronavirus tipa 2 s hudim akutnim respiratornim sindromom. Ko je oseba okužena, so najpogostejši simptomi vročina, kašelj in težko dihanje.

Vzorci, ki se uporabljajo za testiranje, se lahko odvzamejo z nazofaringealnimi ali orofaringealnimi brisi.

Kaj je PCR?

Standardna metoda odkrivanja koronavirusa je verižna reakcija s polimerazo, PCR.To je metoda, ki se pogosto uporablja v molekularni biologiji.Hitro lahko kopira milijone do milijard specifičnih fragmentov DNK.

Novi koronavirus vsebuje zelo dolg genom enoverižne RNA.Za odkrivanje teh virusov s PCR je treba molekule RNA pretvoriti v njihova komplementarna zaporedja DNA z reverzno transkriptazo, nato pa je mogoče novo sintetizirano DNA pomnožiti s standardnimi postopki PCR, ki so splošno znani kot RT-PCR.

RT-PCR postopek

Ekstrakcija RNA

Za izvedbo te metode je treba v bistvu ekstrahirati virusno RNA.Za priročno, hitro in učinkovito ločevanje je mogoče uporabiti različne komplete za čiščenje RNA.

Za ekstrahiranje virusne RNK s komercialnim kompletom najprej dodajte vzorec v epruveto za mikrocentrifugo in ga nato zmešajte z liznim pufrom.Ta pufer je močno denaturiran in je običajno sestavljen iz fenola in gvanidin izotiocianata.Poleg tega so zaviralci RNaze običajno prisotni v pufru za lizo, da se zagotovi izolacija intaktne virusne RNA.

Po dodajanju liznega pufra mešalno epruveto vrtinčimo s pulzom in inkubiramo pri sobni temperaturi.Virus se nato lizira pod pogoji visoke denaturacije, ki jih zagotavlja lizni pufer.

Ko se vzorec lizira, se za postopek čiščenja uporabi centrifugalna epruveta.Vzorec se naloži v epruveto za centrifugo in nato centrifugira.

Ta postopek je metoda ekstrakcije v trdni fazi, pri kateri je stacionarna faza sestavljena iz matrice silikagela.

Pri optimalnih pogojih soli in pH se molekule RNA vežejo na silicijevo membrano.

Hkrati se odstranijo beljakovine in drugi onesnaževalci.

Po centrifugiranju vstavite epruveto za centrifugo v čisto zbirno epruveto, zavrzite filtrat in dodajte pralni pufer.

Epruveto znova postavite v centrifugo, da potisnete pralni pufer skozi membrano.To bo odstranilo vse preostale nečistoče z membrane, tako da bo ostala samo RNA, vezana na silikagel.

Ko je vzorec opran, postavite epruveto v čisto mikrocentrifugirno epruveto in dodajte elucijski pufer.

Nato se centrifugira, da potisne elucijski pufer skozi membrano.Elucijski pufer odstrani virusno RNA iz vrtilne kolone in pridobi prečiščeno RNA brez beljakovin, inhibitorjev in drugih kontaminantov.

2. KORAK

Mešani koncentrat

Po ekstrakciji virusne RNA je naslednji korak priprava reakcijske mešanice za PCR pomnoževanje.V tem koraku se uporablja koncentrat.Ta koncentrirana raztopina je vnaprej pripravljena koncentrirana raztopina, sestavljena iz predmešanice, reverzne transkriptaze, nukleotidov, prednjega primerja, povratnega primerja, sonde TaqMan in DNA polimeraze.

Nazadnje se za dokončanje te reakcijske zmesi doda šablona RNA.Epruvete se premešajo s pulznim vrtinčenjem, nato pa se reakcijska zmes naloži v ploščo PCR.PCR plošča običajno vsebuje 96 vdolbinic in lahko analizira več vzorcev hkrati.

3. KORAK

PCR pomnoževanje

Nato postavite ploščo v napravo za PCR, ki je v bistvu termocikler.

RT-PCR v realnem času se uporablja za odkrivanje novega koronavirusa 2019 z ojačanjem ciljnega zaporedja v genu RdrRP, genu E in genu N.Izbira ciljnega gena je odvisna od zaporedja primerja in sonde.

Prvi korak RT-PCR je reverzna transkripcija.Sintetizira se prva veriga komplementarne DNA, ki jo sproži reverzni primer PCR, ki se veže na komplementarni del genoma virusne RNA.Nato reverzna transkriptaza doda nukleotide DNA na 3′-konec primerja, da sintetizira DNA, komplementarno virusni RNA.Temperatura in trajanje tega koraka sta odvisna od uporabljenih primerjev, ciljne RNA in reverzne transkriptaze.

Nato se izvede začetni korak denaturacije, ki povzroči denaturacijo hibrida RNA-DNA.Ta korak je potreben za aktiviranje DNA polimeraze.Hkrati je reverzna transkriptaza inaktivirana.

PCR je sestavljen iz serije toplotnih ciklov.Vsak cikel je sestavljen iz korakov denaturacije, žarjenja in podaljšanja.

Stopnja denaturacije vključuje segrevanje reakcijske komore na 95 stopinj Celzija in njeno uporabo za denaturacijo predloge dvoverižne DNK.

V naslednjem koraku se reakcijska temperatura zniža na 58 stopinj Celzija, kar omogoči, da se sprednji primer prižge s komplementarnim delom svoje enoverižne DNA šablone.Temperatura žarjenja je neposredno odvisna od dolžine in sestave temeljnega premaza.

V koraku podaljšanja DNA polimeraza sintetizira novo DNA verigo, ki je komplementarna vzorčni verigi DNA.Z dodajanjem prostih jeder, ki so komplementarna predlogi v smeri od 5′ do 3′ od reakcijske zmesi.Temperatura tega koraka je odvisna od uporabljene DNA polimeraze.

Po prvem ciklu dobimo tarčo dvoverižne DNA.

Nato vstopite v drugi cikel.Dvoverižna DNK je denaturirana, da nastaneta dve enoverižni molekuli DNK.

V naslednjem koraku se reakcijska temperatura zniža, primerji se prižgejo na vsako šablono enoverižne DNA in sonda Taq-man se prižge na komplementarni del ciljne DNA.

Sonda TaqMan je sestavljena iz fluoroforja, kovalentno vezanega na 5′-konec oligonukleotidne sonde.Ko ga vzbudi svetlobni vir ciklerja, fluorofor oddaja fluorescenco.Poleg tega je sonda sestavljena iz dušilca ​​na 3′ koncu.Bližina reporterskega gena dušilcu preprečuje detekcijo fluorescence.

V koraku podaljševanja DNA polimeraza sintetizira novo verigo.Ko polimeraza doseže sondo TaqMan, njena aktivnost endogene 5'nukleaze cepi sondo in loči barvilo od dušilca.

Z vsakim ciklom PCR se sprosti več molekul barvila, kar povzroči povečanje intenzivnosti fluorescence sorazmerno s številom sintetiziranih amplikonov.

Ta metoda omogoča oceno števila danega zaporedja, prisotnega v vzorcu.Število dvoverižnih fragmentov DNK se v vsakem ciklu podvoji.Zato se PCR lahko uporablja za analizo zelo majhnih vzorcev.

Za merjenje fluorescenčnega signala, volframove halogenske žarnice, vzbujalnega filtra, reflektorja, leče, emisijskega filtra in nabojno sklopljene naprave uporabite kamero CCD.

4. KORAK Zaznaj

Za merjenje fluorescenčnega signala, volframove halogenske žarnice, vzbujalnega filtra, reflektorja, leče, emisijskega filtra in nabojno sklopljene naprave uporabite kamero CCD.

Filtrirana svetloba svetilke se odbija od reflektorja, gre skozi zbiralno lečo in se usmeri v sredino vsake luknje.Nato se fluorescenca, ki jo oddaja luknja, odbije od ogledala, gre skozi emisijski filter in jo zazna CCD kamera.V vsakem ciklu PCR lahko CCD zazna samovzbujeno fluoroforno svetlobo.

Zajeto svetlobo pretvori v digitalne podatke.Ta metoda se imenuje PCR v realnem času in omogoča spremljanje poteka reakcije PCR v realnem času.