Vsi govorijo o principu eksperimenta qRT-PCR, oblikovanju primerja, interpretaciji rezultatov itd., vendar mislim, da bi moral z vami deliti eksperimentalno delovanje qRT-PCR.Je malo, a gre za rezultate.
Preden izvedemo qRT-PCR, moramo jasno razumeti lastno RNK in metode delovanja.Navsezadnje so naša prizadevanja usmerjena v doseganje rezultatov in ne le v vadbo.Torej, preden izvedemo qRT-PCR, moramo ugotoviti naslednje težave (nekatere so uporabne samo za SYBR).
1 Ste prepričani, da vaša RNA ni razgrajena?
NanoDrop 2000 lahko zazna samo koncentracijo in čistost RNA, ne more pa zaznati celovitosti RNA.
Vrednost RNA (RNA Intesity Number) lahko odraža celovitost RNA, ki jo zazna sistem Agilent 2100 Bioanalyzer.
Slika. Shematski diagram vrednosti RIN za različne vzorce RNA (evkarionti)
Vendar pa laboratoriji na splošno nimajo bioanalizatorja Agilent 2100.V tem primeru lahko detektiramo preko formaldehidnega gela, vendar je zahteva po skupni količini RNK velika, zato je najhitrejša metoda navadna gelska elektroforeza.Mora biti v okolju brez nukleaze, zato je treba rezervoar za elektroforezo, steklenico za sol, nosilec za gel in glavnik sprati z DEPC vodo.Agaroza je tudi brez nukleaze (dokler je sveže odprta), nakladalni pufer pa mora biti čim bolj sveže odprt z 1,2 % gelom.
Upoštevajte, da mora biti gel popolnoma raztopljen, sicer bo povzročil nehomogene pasove, kot je prikazano v vzorcu 9 na sliki.Če je napetost previsoka ali če deluje predolgo, bo to povzročilo toploto in povzročilo degradacijo RNA, zato je treba napetost in čas razumno nadzorovati.Poleg tega lahko s pretokom gela dodatno ugotovite, ali je v vzorcu ostanek DNK, in opazite, ali je v razdelilni vdolbinici veliko število zadržanih trakov.
Slika.Zaznavanje RNA z gelsko elektroforezo
2 Ali ste prepričani o koncentraciji vaše cDNA?
Izkušnja velikih bratov v laboratoriju je, da je cDNA sistema 20 ul, dobljena z vsako inverzijo, neposredno razredčena 20X, medtem ko so podoktorske sestre razredčene 10X.Ponavadi sem odvisen od situacije.Ker je kakovost RNA, ki jo omenja vsaka oseba, drugačna, je tudi stopnja obračanja drugačna in tehnologija obrata morda ni stabilna.
Torej vsakič, ko dobim obrnjeno cDNA, jo bom najprej razredčil približno 3-krat, nato pa uporabil gospodinjski gen za RT-PCR, število ciklov je običajno 25 ciklov, da identificiram specifično koncentracijo in nato določim končni faktor redčenja.
3 Ali ste prepričani, da so vaši primerji enostavni za uporabo?
Lahko prestane krivuljo taljenja qRT-PCR, vendar to še vedno stane.Za laboratorije brez veliko denarja, ko dobijo veliko primerjev, lahko uporabijo navaden RT-PCR, da vidijo, ali gre za en sam trak, in ugotovijo specifičnost primerjev.Če laboratoriju ne primanjkuje denarja, se lahko specifičnost vseh primerjev enkrat ugotovi preko talilne krivulje.
4 Ali ste prepričani, da so vaši poskusni pogoji primerni?
SYBR je treba zaščititi pred močno svetlobo, zato poskusite izklopiti stropno luč, ko dodajate reagent SYBR, in za dokončanje uporabite le šibko svetlobo.
Shranjujte SYBR pri 4 °C.Med uporabo nežno obračajte navzgor in navzdol, da dobro premešate, da preprečite penjenje, in ne mešajte močno.
Nekatere mlajše sestre rade rišejo oznake na PCR ploščo, ker se bojijo, da bi pomešale vzorce, kar je napačno.Ker je zelo verjetno, da bodo vaši označevalci vplivali na zbiranje fluorescenčnih signalov, na splošno priporočam mlajšim, da za pomoč pri spominu uporabljajo eksperimentalne zvezke, kot je prikazano spodaj.
Slika.Diagram nalaganja vzorca qRT-PCR
5 Ste prepričani, da delate prav?
Nosite rokavice, nosite rokavice, nosite rokavice in trikrat povejte pomembne stvari.
Da bi zmanjšal izpostavljenost SYBR svetlobi, osebno rad najprej dodam predlogo, kot je prikazano na spodnji sliki.Izkušnje kažejo, da bo dodatek majhne količine predloge verjetno povzročil napake pri vzorčenju.Zato, da zmanjšam napako, ki jo povzroča dodajanje majhne količine šablone, običajno znova podvojim vzorec in podvojim količino, ko dodam vzorec, da zmanjšam količino dodanega H2O2.
Slika.Shematski diagram nalaganja qRT-PCR
Nato konfigurirajte sistem qRT-PCR, kot sledi.
Slika.Diagram priprave sistema qRT-PCR
OPOMBA: Postopek konfiguracije je treba izvesti na ledu.
Po dodajanju vzorca prilepite prozorno tesnilno folijo.Poskusite se ne dotikati površine prozorne tesnilne folije z rokami, samo upravljajte iz prostora na obeh straneh folije.Ker lahko tudi prstni odtisi vplivajo na zbiranje fluorescentnih signalov.Nato uporabite centrifugo za hitro centrifugiranje 10 s pri nizki hitrosti, da preprečite, da bi vzorec visel na steni.
Podobni izdelki:
Čas objave: 28. aprila 2023
