Ker je nova v laboratoriju, ni dobro izločiti pozitivnih rastlin iz skupine rastlin z nizko stopnjo konverzije.Najprej je treba DNK ekstrahirati iz velikega števila vzorcev enega za drugim, nato pa bodo tuje gene odkrili s PCR.Vendar so rezultati pogosto prazni in pasovi z nekaj predmeti občasno, vendar je nemogoče ugotoviti, ali gre za zgrešena zaznavanja ali lažna zaznavanja..Je zelo nemočno soočiti se s takšnim eksperimentalnim procesom in rezultati?Ne skrbi, brat te nauči, kako enostavno in natančno odločiti transgene pozitivne rastline.

Korak 1

Primeri za odkrivanje dizajna

Določite endogeni gen in eksogeni gen, ki ju je treba odkriti glede na vzorec, ki ga želite testirati, in izberite reprezentativno zaporedje 100–500 bp v genu za oblikovanje primerja.Dobri primerji lahko zagotovijo natančnost rezultatov detekcije in skrajšajo čas detekcije (glejte dodatek za pogosto uporabljene primerje detekcije).

Obvestilo: Novo zasnovani primerji morajo optimizirati reakcijske pogoje in preveriti točnost, natančnost in mejo zaznavanja pred obsežnim zaznavanjem.

2. korak

Oblikujte eksperimentalni protokol

Pozitivna kontrola: Uporabite očiščeno DNK, ki vsebuje ciljni fragment, kot predlogo, da ugotovite, ali so reakcijski sistem PCR in pogoji normalni.

Negativna/slepa kontrola: Uporabite predlogo DNK ali ddH2O, ki ne vsebuje ciljnega fragmenta, kot predlogo, da odkrijete, ali je v sistemu PCR vir kontaminacije.

Notranja referenčna kontrola: uporabite kombinacijo primerja/sonde endogenega gena vzorca, ki ga želite testirati, da ocenite, ali je predlogo mogoče zaznati s PCR.

Opaziti:

Pozitivne, negativne/slepe kontrole in notranje kontrole je treba nastaviti za vsak preskus, da se oceni veljavnost eksperimentalnih rezultatov.

Priprava poskusa

Pred uporabo preverite, ali je raztopina enakomerno zmešana.Če se pojavi oborina, jo je treba pred uporabo raztopiti in premešati v skladu z navodili.Mešanico 2×PCR je treba pred uporabo pipetirati in večkrat premešati z mikropipeto, da preprečite neenakomerno porazdelitev ionov.

Opaziti:

Vzemite ven priročnik in ga natančno preberite ter se pred poskusom pripravite v strogem skladu z zahtevami priročnika.

4. korak

Pripravite reakcijski sistem PCR

V skladu z eksperimentalnim protokolom enakomerno zmešajte primerje, H2O in 2 × PCR, centrifugirajte in jih porazdelite v vsako reakcijsko epruveto.

Opaziti:

Za obsežno ali dolgoročno testiranje je priporočljiva uporaba reakcijskega sistema PCR, ki vsebuje encim UNG, s katerim se je mogoče učinkovito izogniti kontaminaciji z aerosoli, ki jo povzročajo produkti PCR.

5. korak

Dodajte reakcijsko predlogo

Z uporabo tehnologije Direct PCR ni potrebe po dolgočasnem procesu čiščenja nukleinske kisline, vzorčno predlogo lahko pripravimo v 10 minutah in dodamo ustrezen reakcijski sistem PCR.

Opaziti:

Metoda cepitve ima boljši učinek detekcije, dobljeni produkt pa se lahko uporabi za več reakcij detekcije.

5.1: Neposredno širjenje listov

Glede na velikost slike v priročniku odrežite listno tkivo premera 2-3 mm in ga položite v reakcijski sistem PCR.

Opomba: Zagotovite, da so delci listov popolnoma potopljeni v reakcijsko raztopino PCR, in ne dodajajte odvečnega listnega tkiva.

5.2: Metoda razcepa listov

Odrežite listno tkivo s premerom 5-7 mm in ga položite v epruveto za centrifugiranje.Če izberete zrele liste, se izogibajte uporabi tkiv glavne žile lista.Odpipetirajte 50 ul lizata pufra P1 v epruveto za centrifugo, da zagotovite, da lahko lizat popolnoma potopi listno tkivo, ga postavite v termocikler ali kovinsko kopel in lizirajte pri 95 °C 5-10 minut.

Dodajte 50 ul nevtralizacijske raztopine pufra P2 in dobro premešajte.Nastali lizat se lahko uporabi kot predloga in doda v reakcijski sistem PCR.

Opomba: Količina šablone je med 5-10 % sistema PCR in ne sme preseči 20 % (na primer, v sistemu 20 μl PCR dodajte 1-2 μl raztopine za lizo, ne več kot 4 μl).

6. korak

PCR reakcija

Po centrifugiranju reakcijske epruvete PCR se le-ta postavi v instrument PCR za pomnoževanje.

Opaziti:

Reakcija za pomnoževanje uporablja neprečiščeno šablono, tako da je število pomnoževalnih ciklov 5-10 več ciklov kot pri uporabi prečiščene DNA šablone.

korak 7

Zaznavanje in analiza rezultatov elektroforeze

M: DNK lestvica 100 bp

1\4: Metoda prečiščene DNK

2\5: Direktna metoda PCR

3\6: Prazen nadzor

QC:

Rezultati preskusa različnih kontrol, nastavljenih v poskusu, morajo izpolnjevati naslednje pogoje.V nasprotnem primeru je treba analizirati vzrok težave in po odpravi težave ponovno opraviti test.

Tabela 1. Normalni rezultati testov različnih kontrolnih skupin

*Če se plazmid uporablja kot pozitivna kontrola, je rezultat testa endogenega gena lahko negativen

Ocena rezultata:

A. Rezultat testa endogenega gena vzorca je negativen, kar pomeni, da DNK, ki je primerna za običajno detekcijo PCR, ni mogoče ekstrahirati iz vzorca ali da ekstrahirana DNK vsebuje zaviralce reakcije PCR, zato je treba DNK ponovno ekstrahirati.

B. Rezultat testa endogenega gena v vzorcu je pozitiven, rezultat testa eksogenega gena pa je negativen, kar pomeni, da je iz vzorca ekstrahirana DNK, primerna za običajno detekcijo PCR, in se lahko oceni, da gen XXX ni zaznan v vzorcu.

C. Rezultat testa endogenega gena v vzorcu je pozitiven, rezultat testa eksogenega gena pa je pozitiven, kar pomeni, da je bila iz vzorca ekstrahirana DNK, primerna za običajno PCR detekcijo, DNK vzorca pa vsebuje gen XXX.Potrditvene poskuse je mogoče nadalje izvajati.

8. korak

Primeri za odkrivanje dizajna

Po poskusu uporabite 2% raztopino natrijevega hipoklorita in 70% raztopino etanola, da obrišete poskusno območje, da preprečite onesnaženje okolja.