一、Povečajte občutljivost reakcijskega sistema:

1. Izolirajte visoko kakovostno RNA:

Uspešna sinteza cDNA prihaja iz visokokakovostne RNA.Visokokakovostna RNA mora biti vsaj polne dolžine in brez zaviralcev reverzne transkriptaze, kot sta EDTA ali SDS.Kakovost RNA določa največjo količino informacij o zaporedju, ki jih lahko prepišete v cDNA.Običajna metoda čiščenja RNA je enostopenjska metoda z uporabo gvanidin izotiocianata/kislega fenola.Da bi preprečili kontaminacijo s sledovi RNaze, je treba RNK, izolirano iz vzorcev, bogatih z RNazo (kot je trebušna slinavka), shraniti v formaldehidu, da se ohrani visokokakovostna RNK, zlasti za dolgoročno shranjevanje.RNK, ekstrahirana iz podganje jeter, se je v bistvu razgradila po enem tednu shranjevanja v vodi, medtem ko je RNA, ekstrahirana iz podganje vranice, ostala stabilna po 3 letih shranjevanja v vodi.Poleg tega so transkripti, daljši od 4 kb, bolj občutljivi na razgradnjo s RNazami v sledovih kot majhni transkripti.Da bi povečali stabilnost shranjenih vzorcev RNA, lahko RNA raztopite v deioniziranem formamidu in shranite pri -70 °C.Formamid, ki se uporablja za ohranjanje RNA, ne sme vsebovati ostankov, ki razgrajujejo RNA.RNA iz trebušne slinavke se lahko hrani v formamidu vsaj eno leto.Ko se pripravljate na uporabo RNA, lahko uporabite naslednjo metodo za obarjanje RNA: dodajte NaCl do 0,2 M in 4-kratni volumen etanola, postavite na sobno temperaturo 3-5 minut in centrifugirajte pri 10.000 × g 5 minut.

2. Uporabite RNaseH-neaktivno (RNaseH-) reverzno transkriptazo:

Zaviralci RNaze se pogosto dodajo reakcijam povratne transkripcije, da se poveča dolžina in izkoristek sinteze cDNA.Inhibitorje RNaze je treba dodati med reakcijo sinteze prve verige v prisotnosti pufra in redukcijskega sredstva (kot je DTT), ker postopek pred sintezo cDNA denaturira inhibitor, s čimer se sprosti vezana RNaza, ki lahko razgradi RNA.Zaviralci proteinske RNaze preprečujejo samo razgradnjo RNK z RNazo A, B, C in ne preprečujejo RNaze na koži, zato bodite previdni, da kljub uporabi teh zaviralcev ne vnesete RNaze s prstov.

Reverzna transkriptaza katalizira pretvorbo RNA v cDNA.Tako M-MLV kot AMV imata poleg lastne polimerazne aktivnosti endogeno aktivnost RNaseH.Aktivnost RNAseH in aktivnost polimeraze tekmujeta med seboj za hibridno verigo, ki nastane med predlogo RNA in prajmerjem DNA ali podaljškom cDNA, in razgrajujeta verigo RNA v kompleksu RNA:DNA.Predloga RNA, razgrajena z aktivnostjo RNaseH, ne more več služiti kot učinkovit substrat za sintezo cDNA, kar zmanjša izkoristek in dolžino sinteze cDNA.Zato bi bilo koristno odpraviti ali močno zmanjšati aktivnost RNaseH reverzne transkriptaze.。

Reverzna transkriptaza SuperScript Ⅱ, reverzna transkriptaza RNaseH-MMLV in reverzna transkriptaza thermoScript, RNaseH-AMV, lahko pridobita večjo količino in več cDNA polne dolžine kot MMLV in AMV.Na občutljivost RT-PCR bo vplivala količina sinteze cDNA.ThermoScript je veliko bolj občutljiv kot AMV.Velikost produktov RT-PCR je omejena s sposobnostjo reverzne transkriptaze, da sintetizira cDNA, zlasti pri kloniranju večjih cDNA.V primerjavi z MMLV je SuperScripⅡ znatno povečal izkoristek dolgih produktov RT-PCR.RNazaH-reverzna transkriptaza ima tudi povečano termostabilnost, zato lahko reakcijo izvajamo pri temperaturah, ki so višje od običajnih 37-42°C.Pri predlaganih pogojih sinteze uporabite oligo(dT) primer in 10 μCi [α-P]dCTP.Skupni donos prve verige je bil izračunan z metodo TCA precipitacije.Celotno cDNA smo analizirali z uporabo pasov, razvrščenih po velikosti, izrezanih in preštetih na alkalnem agaroznem gelu.

3. Zvišajte temperaturo inkubacije za reverzno transkripcijo:

Višja temperatura inkubacije pomaga odpreti sekundarno strukturo RNK, kar poveča izkoristek reakcije.Za večino šablon RNA bo inkubacija RNA in primerjev pri 65 °C brez pufra ali soli, čemur sledi hitro ohlajanje na ledu, odstranila večino sekundarnih struktur in omogočila vezavo primerjev.Vendar imajo nekatere predloge še vedno sekundarne strukture, tudi po toplotni denaturaciji.Pomnoževanje teh težavnih predlog se lahko izvede z uporabo reverzne transkriptaze ThermoScript in postavitvijo reakcije reverzne transkripcije na višjo temperaturo za izboljšanje pomnoževanja.Višje inkubacijske temperature lahko tudi povečajo specifičnost, zlasti če se za sintezo cDNA uporabljajo gensko specifični primerji (GSP) (glejte 3. poglavje).Če uporabljate GSP, zagotovite, da je Tm primerjev enak pričakovani inkubacijski temperaturi.Ne uporabljajte oligo(dT) in naključnih primerjev nad 60 °C.Naključni primerji zahtevajo inkubacijo pri 25 °C 10 minut, preden se temperatura dvigne na 60 °C.Poleg uporabe višje temperature reverzne transkripcije je mogoče izboljšati specifičnost tudi z neposrednim prenosom mešanice RNA/primera s temperature denaturacije 65 °C na temperaturo inkubacije reverzne transkripcije in dodajanjem predhodno segrete 2× reakcijske zmesi (cDNA hot-start synthesis) .Ta pristop pomaga preprečiti medmolekularno združevanje baz, ki se pojavi pri nižjih temperaturah.Večkratno preklapljanje temperature, potrebno za RT-PCR, je mogoče poenostaviti z uporabo termičnega ciklerja.

Tth termostabilna polimeraza deluje kot DNA polimeraza v prisotnosti Mg2+ in kot RNA polimeraza v prisotnosti Mn2+.Hranimo ga lahko na toplem pri temperaturi največ 65°C.Vendar pa prisotnost Mn2+ med PCR zmanjša natančnost, zaradi česar je polimeraza Tth manj primerna za visoko natančno pomnoževanje, kot je kloniranje cDNA.Poleg tega ima Tth nizko učinkovitost reverzne transkripcije, kar zmanjša občutljivost, in ker je reverzno transkripcijo in PCR mogoče izvesti z enim samim encimom, kontrolnih reakcij brez reverzne transkripcije ni mogoče uporabiti za primerjavo produktov pomnoževanja cDNA s kontaminirano genomsko DNA.Produkti pomnoževanja so bili ločeni.

4. Dodatki, ki spodbujajo povratno prepisovanje:

Dodatki, vključno z glicerolom in DMSO, so dodani reakciji sinteze prve verige, kar lahko zmanjša stabilnost dvojne verige nukleinske kisline in razveže sekundarno strukturo RNA.Dodate lahko do 20 % glicerola ali 10 % DMSO, ne da bi to vplivalo na aktivnost SuperScript II ali MMLV.AMV lahko prenese tudi do 20 % glicerola brez izgube aktivnosti.Da bi povečali občutljivost RT-PCR v reakciji reverzne transkripcije SuperScriptⅡ, lahko dodate 10 % glicerola in ga inkubirate pri 45 °C.Če k PCR dodamo 1/10 reakcijskega produkta reverzne transkripcije, potem je koncentracija glicerola v reakciji pomnoževanja 0,4 %, kar ni dovolj za zaviranje PCR.

5. Zdravljenje z RNAseH:

Obdelava reakcij sinteze cDNA z RNAseH pred PCR lahko poveča občutljivost.Za nekatere predloge se domneva, da RNA v reakciji sinteze cDNA preprečuje vezavo produktov pomnoževanja, v tem primeru lahko zdravljenje z RNaseH poveča občutljivost.Na splošno je zdravljenje z RNaseH potrebno pri pomnoževanju daljših ciljnih predlog cDNA polne dolžine, kot je tuberozna sheroza II z majhnim številom kopij.Za to težavno predlogo je zdravljenje z RNaseH izboljšalo signal, ki ga je ustvaril SuperScript II ali cDNA, sintetizirana z AMV.Za večino reakcij RT-PCR je obdelava z RNaseH neobvezna, ker stopnja denaturacije PCR pri 95 °C na splošno hidrolizira RNA v kompleksu RNA:DNA.

6. Izboljšanje metode odkrivanja majhne RNA:

RT-PCR je še posebej zahtevna, ko so na voljo le majhne količine RNA.Glikogen, dodan kot nosilec med izolacijo RNA, pomaga povečati donos majhnih vzorcev.Hkrati z dodajanjem Trizola se lahko doda glikogen brez RNaze.Glikogen je topen v vodi in ga je mogoče vzdrževati v vodni fazi z RNA, da pomaga pri kasnejšem obarjanju.Za vzorce, manjše od 50 mg tkiva ali 106 gojenih celic, je priporočena koncentracija glikogena brez RNaze 250 μg/ml.

Dodajanje acetiliranega BSA reakciji reverzne transkripcije z uporabo SuperScript II lahko poveča občutljivost, za majhne količine RNA pa lahko zmanjšanje količine SuperScript II in dodajanje 40 enot zaviralca nukleaze RNaseOut poveča stopnjo zaznave.Če se v procesu izolacije RNK uporablja glikogen, je pri uporabi SuperScript II za reakcijo reverzne transkripcije še vedno priporočljivo dodati BSA ali inhibitor RNaze.

二、Povečajte specifičnost RT-PCR

1. Asinteza CND:

Sintezo prve verige cDNA lahko sprožimo s tremi različnimi metodami, katerih relativna specifičnost vpliva na količino in vrsto sintetizirane cDNA.

Metoda naključnega primerja je bila najmanj specifična od treh metod.Primerji se žarijo na več mestih v celotnem zapisu, kar ustvarja kratke cDNA z delno dolžino.Ta metoda se pogosto uporablja za pridobivanje 5' končnih zaporedij in za pridobivanje cDNA iz predlog RNA z regijami sekundarne strukture ali s terminacijskimi mesti, ki jih ni mogoče podvojiti z reverzno transkriptazo.Za pridobitev najdaljše cDNA je treba empirično določiti razmerje med primerji in RNA v vsakem vzorcu RNA.Začetna koncentracija naključnih primerjev je bila od 50 do 250 ng na 20 μl reakcije.Ker je cDNA, sintetizirana iz celotne RNA z uporabo naključnih primerjev, predvsem ribosomska RNA, je poli(A)+RNA na splošno izbrana kot predloga.

Oligo(dT) primerji so bolj specifični kot naključni primerji.Hibridizira se s poli(A) repom, ki ga najdemo na 3' koncu večine evkariontskih mRNA.Ker poli(A)+ RNA predstavlja približno 1 % do 2 % celotne RNA, sta količina in kompleksnost cDNA veliko manjši kot pri naključnih primerjih.Zaradi svoje visoke specifičnosti oligo(dT) na splošno ne zahteva optimizacije razmerja med RNA in primerji in selekcije poli(A)+.Priporočena je uporaba 0,5 μg oligo(dT) na 20 μl reakcijskega sistema.oligo(dT)12-18 je primeren za večino RT-PCR.Sistem ThermoScript RT-PCR ponuja oligo(dT)20 zaradi svoje boljše toplotne stabilnosti pri višjih temperaturah inkubacije.

Gene specific primers (GSP) so najbolj specifični primerji za korak povratne transkripcije.GSP je protismiselni oligonukleotid, ki se lahko specifično hibridizira s ciljnim zaporedjem RNA, za razliko od naključnih primerjev ali oligo(dT), ki se prižgejo na vse RNA.Ista pravila, ki se uporabljajo za načrtovanje primerjev PCR, veljajo za načrtovanje GSP v reakcijah reverzne transkripcije.GSP je lahko enako zaporedje kot pomnoževalni primer, ki se prižge na najbolj 3'-koncu mRNA, ali pa je GSP lahko zasnovan tako, da se prižge za začetnim pomnoževanjem za obratno pomnoževanje.Pri nekaterih pomnoženih osebah je treba za uspešno RT-PCR oblikovati več kot en protismiselni primer, ker lahko sekundarna struktura ciljne RNA prepreči vezavo primerja.Priporočljivo je uporabiti 1 pmol protismiselnega GSP v 20 μl reakcije sinteze prve verige.

2. Zvišajte temperaturo inkubacije za reverzno transkripcijo:

Da bi v celoti izkoristili vse prednosti specifičnosti GSP, je treba uporabiti reverzno transkriptazo z večjo termostabilnostjo.Termostabilne reverzne transkriptaze lahko inkubiramo pri višjih temperaturah, da povečamo strogost reakcije.Na primer, če se GSP žari pri 55 °C, specifičnost GSP ne bo v celoti izkoriščena, če se za reverzno transkripcijo uporablja AMV ali M-MLV pri nizki strogosti 37 °C.Vendar lahko SuperScript II in ThermoScript reagirata pri 50 °C ali več, kar bo odpravilo nespecifične produkte, ki nastanejo pri nižjih temperaturah.Za največjo specifičnost lahko mešanico RNA/primera prenesete neposredno s temperature denaturacije 65 °C na temperaturo inkubacije reverzne transkripcije in dodate v predhodno ogreto reakcijsko mešanico 2× (vroči začetek sinteze cDNA).To pomaga preprečiti združevanje medmolekularnih baz pri nizkih temperaturah.Več temperaturnih prehodov, potrebnih za RT-PCR, je mogoče poenostaviti z uporabo termičnega ciklerja.

3. Zmanjša kontaminacijo genomske DNK:

Morebitna težava pri RT-PCR je kontaminacija genomske DNA v RNA.Uporaba dobre metode izolacije RNA, kot je reagent Trizol, bo zmanjšala količino genomske DNA, ki kontaminira pripravek RNA.Da bi se izognili produktom, pridobljenim iz genomske DNA, lahko RNA obdelamo z DNazo I stopnje pomnoževanja, da odstranimo kontaminirano DNA pred reverzno transkripcijo.Razgradnjo DNaze I smo zaključili z inkubacijo vzorcev v 2,0 mM EDTA 10 minut pri 65 °C.EDTA lahko kelira magnezijeve ione, kar preprečuje hidrolizo RNK, odvisno od magnezijevih ionov, pri visokih temperaturah.

Da bi ločili pomnoženo cDNA od kontaminiranih produktov pomnoževanja genomske DNA, je mogoče oblikovati primerje, ki se vsak žarijo in ločijo eksone.Produkti PCR, pridobljeni iz cDNA, bodo krajši od tistih, pridobljenih iz kontaminirane genomske DNA.Poleg tega je bil na vsaki predlogi RNA izveden kontrolni poskus brez reverzne transkripcije, da bi ugotovili, ali je dani fragment izpeljan iz genomske DNA ali cDNA.Produkt PCR, dobljen brez reverzne transkripcije, izhaja iz genoma.