1. Osnovno znanje (če želite videti eksperimentalni del, prenesite neposredno na drugi del)
Kot izvedena reakcija običajne PCR PCR v realnem času v glavnem spremlja spremembo količine produkta pomnoževanja v vsakem ciklu reakcije pomnoževanja PCR v realnem času s spremembo fluorescenčnega signala in kvantitativno analizira začetno predlogo z razmerjem med vrednostjo ct in standardno krivuljo.
Specifični podatki RT-PCR soizhodišče, fluorescenčni praginCt vrednost.
| izhodišče: | Vrednost fluorescence 3.-15. cikla je osnovna vrednost (baseline), ki je posledica občasne napake meritve. |
| Prag (prag): | Nanaša se na mejo zaznavanja fluorescence, nastavljeno na ustreznem mestu v območju eksponentne rasti krivulje pomnoževanja, na splošno 10-kratno standardno odstopanje od osnovne črte. |
| CT vrednost: | To je število ciklov PCR, ko vrednost fluorescence v vsaki reakcijski epruveti doseže prag. Vrednost Ct je obratno sorazmerna s količino začetne predloge. |
Pogoste metode označevanja za RT-PCR:
| metoda | prednost | pomanjkljivost | področje uporabe |
| SYBR zelenaⅠ | Široka uporabnost, občutljiv, poceni in priročen | Zahteve za primer so visoke, nagnjeni k nespecifičnim pasovom | Primeren je za kvantitativno analizo različnih tarčnih genov, raziskave izražanja genov ter raziskave transgenih rekombinantnih živali in rastlin. |
| TaqMan | Dobra specifičnost in visoka ponovljivost | Cena je visoka in primerna samo za posebne cilje. | Odkrivanje patogenov, raziskave genov za odpornost na zdravila, ocena učinkovitosti zdravil, diagnostika genetskih bolezni. |
| molekularni svetilnik | Visoka specifičnost, fluorescenca, nizko ozadje | Cena je visoka, primeren je le za določen namen, dizajn je težak, cena pa visoka. | Specifična genska analiza, SNP analiza |
2. Eksperimentalni koraki
2.1 O eksperimentalnem združevanju- v skupini mora biti več vrtin in biti morajo biološke ponovitve.
| ① | Prazen nadzor | Uporablja se za ugotavljanje stanja celične rasti v poskusih |
| ② | Negativna kontrola siRNA (nespecifično zaporedje siRNA) | Pokažite specifičnost delovanja RNAi.siRNA lahko inducira nespecifični odziv na stres pri koncentraciji 200 nM. |
| ③ | Kontrola transfekcijskega reagenta | Izključite toksičnost transfekcijskega reagenta za celice ali učinek na izražanje ciljnega gena |
| ④ | siRNA proti ciljnemu genu | Zmanjšajte izražanje ciljnega gena |
| ⑤ (neobvezno) | pozitivna siRNA | Uporablja se za odpravljanje poskusnih sistemskih in operativnih težav |
| ⑥ (neobvezno) | Fluorescentna kontrolna siRNA | Učinkovitost celične transfekcije lahko opazujemo z mikroskopom |
2.2 Načela oblikovanja primerja
| Povečana velikost fragmenta | Po možnosti 100-150 bp |
| Primerna dolžina | 18-25bp |
| GC vsebina | 30%-70%, po možnosti 45%-55% |
| Tm vrednost | 58-60 ℃ |
| Zaporedje | Izogibajte se neprekinjenemu T/C;A/G neprekinjeno |
| 3 končno zaporedje | Izogibajte se GC rich ali AT rich;končna osnova je prednostno G ali C;najbolje se je izogibati T |
| Komplementarnost | Izogibajte se komplementarnim zaporedjem več kot 3 baz znotraj primerja ali med dvema primerjema |
| Specifičnost | Uporabite blast iskanje, da potrdite specifičnost primerja |
①SiRNA je specifična za vrsto in zaporedja različnih vrst bodo drugačna.
②SiRNA je pakirana v zmrznjeno posušen prašek, ki ga lahko stabilno hranite 2-4 tedne pri sobni temperaturi.
2.3 Orodja ali reagenti, ki jih je treba pripraviti vnaprej
| Primer (notranja referenca) | Vključno z dvema za naprej in nazaj |
| Primerji (tarčni gen) | Vključno z dvema za naprej in nazaj |
| Target Si RNA (3 trakovi) | Na splošno bo podjetje sintetiziralo 3 trakove in nato z RT-PCR izbralo enega od treh |
| Komplet za transfekcijo | Lipo2000 itd. |
| Komplet za hitro ekstrakcijo RNA | Za ekstrakcijo RNK po transfekciji |
| Komplet za hitro obratno prepisovanje | za sintezo cDNA |
| Komplet za pomnoževanje PCR | 2×Super SYBR Green Glavna mešanica qPCR |
2.4 V zvezi s težavami, ki jim je treba posvetiti pozornost v posebnih poskusnih korakih:
①proces transfekcije siRNA
1. Za nasaditev lahko izberete ploščo s 24 vdolbinicami, ploščo z 12 vdolbinicami ali ploščo s 6 vdolbinicami (povprečna koncentracija RNA, predlagana v vsaki vdolbinici plošče s 24 vdolbinicami, je približno 100–300 ng/uL), optimalna gostota transfekcije celic pa je do 60 %–80 % oz.
2. Koraki transfekcije in posebne zahteve so strogo v skladu z navodili.
3. Po transfekciji lahko odvzamete vzorce v 24-72 urah za detekcijo mRNA (RT-PCR) ali detekcijo beljakovin v 48-96 urah (WB)
② Postopek ekstrakcije RNK
1. Preprečite kontaminacijo z eksogenimi encimi.Vključuje predvsem strogo nošenje mask in rokavic;z uporabo steriliziranih konic pipet in EP cevi;voda, uporabljena v poskusu, mora biti brez RNaze.
2. Priporočljivo je, da naredite dvakrat, kot je predlagano v kompletu za hitro ekstrakcijo, kar bo resnično izboljšalo čistost in izkoristek.
3. Odpadna tekočina se ne sme dotikati kolone RNA.
③ Kvantifikacija RNA
Ko je RNA ekstrahirana, jo je mogoče kvantificirati neposredno z Nanodropom, najmanjši odčitek pa je lahko le 10 ng/ul.
④Postopek povratne transkripcije
1. Zaradi visoke občutljivosti RT-qPCR je treba narediti vsaj 3 vzporedne vdolbinice za vsak vzorec, da preprečite, da bi bil kasnejši Ct preveč drugačen ali da bi bil SD prevelik za statistično analizo.
2. Glavne mešanice ne zamrzujte in odmrzujte večkrat.
3. Vsako cev/luknjo je treba zamenjati z novo konico!Za dodajanje vzorcev ne uporabljajte vedno iste konice pipete!
4. Film, pritrjen na ploščo s 96 vdolbinicami po dodajanju vzorca, je treba zgladiti s ploščo.Najbolje je centrifugirati, preden ga postavite na stroj, da lahko tekočina na steni cevi steče navzdol in odstrani zračne mehurčke.
⑤ Analiza skupne krivulje
| Brez obdobja logaritmične rasti | Možna visoka koncentracija predloge |
| Ni vrednosti CT | Nepravilni koraki za zaznavanje fluorescentnih signalov; razgradnja primerjev ali sond – njeno celovitost je mogoče zaznati s PAGE elektroforezo; nezadostna količina predloge; degradacija šablon – izogibanje vnosu nečistoč ter ponavljajočemu se zamrzovanju in odmrzovanju pri pripravi vzorca; |
| Ct>38 | Nizka učinkovitost ojačanja;produkt PCR je predolg;različne reakcijske komponente se razgradijo |
| Linearna ojačitvena krivulja | Sonde se lahko delno razgradijo zaradi ponavljajočih se ciklov zamrzovanja in odmrzovanja ali dolgotrajne izpostavljenosti svetlobi |
| Še posebej velika je razlika pri podvojenih luknjah | Reakcijska raztopina ni popolnoma stopljena ali reakcijska raztopina ni mešana;termalna kopel instrumenta PCR je onesnažena s fluorescentnimi snovmi |
2.5 O analizi podatkov
Analizo podatkov qPCR lahko razdelimo na relativno kvantifikacijo in absolutno kvantifikacijo.Na primer, celice v zdravljeni skupini v primerjavi s celicami v kontrolni skupini,
Kolikokrat se mRNA gena X spremeni, to je relativna kvantifikacija;v določenem številu celic mRNA gena X
Koliko izvodov je, to je absolutna kvantifikacija.Običajno v laboratoriju največ uporabljamo relativno kvantitativno metodo.običajno,metoda 2-ΔΔctse največ uporablja v poskusih, zato bo tukaj podrobneje predstavljena le ta metoda.
Metoda 2-ΔΔct: Dobljeni rezultat je razlika v izražanju ciljnega gena v eksperimentalni skupini glede na ciljni gen v kontrolni skupini.Zahteva se, da sta učinkovitost pomnoževanja tako ciljnega gena kot notranjega referenčnega gena blizu 100 %, relativno odstopanje pa ne sme preseči 5 %.
Metoda izračuna je naslednja:
Δct kontrolna skupina = ct vrednost ciljnega gena v kontrolni skupini – ct vrednost notranjega referenčnega gena v kontrolni skupini
Δct eksperimentalna skupina = ct vrednost tarčnega gena v eksperimentalni skupini – ct vrednost internega referenčnega gena v eksperimentalni skupini
ΔΔct=Δct eksperimentalna skupina-Δct kontrolna skupina
Na koncu izračunajte večkratnik razlike v stopnji izražanja:
Change Fold=2-ΔΔct (ustrezna funkcija excel je POWER)
Podobni izdelki:
Čas objave: 20. maj 2023
