Pred kratkim sem odkril nekaj neverjetnega!Številni napredni strokovnjaki za eksperimente okoli njega ne poznajo niti nekaterih zelo osnovnih točk eksperimentalnega znanja.

Ali lahko na primer odgovorite na naslednja vprašanja?

Ali obstaja razlika med OD260 in A260?Kaj vsak pomeni?
OD je okrajšava za optično gostoto (optična gostota), A je okrajšava za absorbanco (absorbanca), pojma sta pravzaprav enaka, »optična gostota« je »absorbanca«, vendar je »optična gostota« v skladu z večino nacionalnih standardov in bolj standardizirana.

Običajno izmerimo vrednost OD pri 260 nm, da izračunamo koncentracijo nukleinske kisline. Kaj torej predstavlja 1OD?
Nukleinska kislina ima največji absorpcijski vrh pri valovni dolžini 260 nm, ki vsebuje tako DNK kot RNK ter fragmentirane fragmente nukleinske kisline (to je ključna točka).
Vrednost OD, izmerjena pri valovni dolžini 260 nm, je bila zabeležena kot OD260.Če je vzorec čist, lahko vrednost OD260 izračuna koncentracijo vzorca nukleinske kisline.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (dvoverižna DNA)
=37 μg/ml ssDNA (enoverižna DNA)
=40 μg/ml RNA
=30 μg/ml dNTP (oligonukleotidi)
Ali obstaja kakšna povezava in razlika med RT-PCR, Realtime-PCR in QPCR?
RT-PCR je okrajšava za PCR z reverzno transkripcijo
PCR v realnem času=qPCR, okrajšava za kvantitativni PCR v realnem času
Čeprav se zdi, da sta PCR v realnem času (fluorescentna kvantitativna PCR v realnem času) in PCR z reverzno transkripcijo (PCR z reverzno transkripcijo) oba skrajšana kot RT-PCR.Toda mednarodna konvencija je: RT-PCR se posebej nanaša na PCR z reverzno transkripcijo.

Kateri so običajno uporabljeni nt, bp in kb za opis dolžine DNA/RNA v biologiji?
nt = nukleotid
bp = bazni par bazni par
kb = kilobaza

Seveda bi rekli, da je marsikomu vseeno za te majhne podrobnosti!Vsi to počnejo in nihče vas ne bo vprašal, kaj je to.Veste, da je to nepotrebno, kajne?

Ne, ne, ne, to je zelo pomembno vedeti!zaradi česa?
Ker želite objaviti članek!brat!Ne glede na to, ali želite diplomirati ali sledite znanstveno-raziskovalnim dosežkom, se morate zanašati na članke, da boste spregovorili!

Ekstrakcija nukleinske kisline bi morala biti najpreprostejši in najosnovnejši poskus.Kakovost ekstrakcije nukleinske kisline neposredno določa rezultate nadaljnjih poskusov.

Čeprav sem že večkrat rekel, je še vedno veliko prijateljev, ki jim ni vseeno.Tokrat sem se odločil, da se umaknem iz članka!

Minimalne informacije za objavo kvantitativnih poskusov PCR v realnem času, imenovanih MIQE, je nabor smernic za kvantitativne poskuse fluorescence, uveden na mednarodni ravni, ki predlaga minimalne standarde za eksperimentalne informacije, potrebne za vrednotenje kvantitativnih poskusov PCR s fluorescenco in objavljanje člankov.Preko eksperimentalnih pogojev in analiznih metod, ki jih zagotovi eksperimentator, lahko pregledovalci bolje ocenijo veljavnost raziskovalčeve eksperimentalne sheme.

Vidimo, da so bili v razdelku ekstrakcije nukleinske kisline predlagani naslednji predmeti detekcije,

»E« označuje informacije, ki jih je treba predložiti, »D« pa informacije, ki jih je treba zagotoviti, če je potrebno.

Obrazec je zelo zapleten, pravzaprav želim reči, da mora vsak začeti

čistost (D), izkoristek (D), celovitost (E) in konsistenco (E) za oceno nukleinskih kislin v teh štirih vidikih.

Glede na eksperimentalne navade najprej spregovorite o metodah vrednotenja čistosti in koncentracije.

Merjenje OD je najljubša in najlažja metoda odkrivanja za eksperimentatorje.Kar se tiče principa, tukaj ne bom šel v podrobnosti.Mnogi laboratoriji zdaj uporabljajo ultra-mikro spektrofotometre za neposredno kvantitativno analizo vzorcev nukleinskih kislin.Med prikazom vrednosti absorbance program neposredno poda vrednost koncentracije (nukleinske kisline, beljakovin in fluorescenčnega barvila) in s tem povezana razmerja.Glede analize vrednosti OD, shranite to sliko in vse bo v redu.

Seznam rešitev univerzalne vrednosti OD

Vendar pa obstaja nekaj opozoril, ki jih je treba posebej izpostaviti.

(Navsezadnje vem, da ste vi tisti, ki varčujete in čakate, dokler jih ne potrebujete!)

Opomba 1 Oprema

Na vrednost OD bo vplivala različna oprema.Dokler je OD260 znotraj določenega območja, sta vrednosti OD230 in OD280 pomembni.Na primer, obseg absorbance običajnega Eppendorf D30 pri 260 nm je 0~3 A, NanoDrop One od Thermo pa pri 260 nm.Območje absorbance 0,5 ~ 62,5 A.

Opomba 2Reagent za redčenje

Na vrednost OD lahko vpliva redčenje različnih reagentov.Na primer, odčitek OD260/280 prečiščene RNA v pH7,5 10 mM Trismedpomnilnik je med 1,9-2,1, medtem ko je vnevtralno vodno raztopinorazmerje bo nižje, morda le 1,8-2,0, vendar to ne pomeni, da se kakovost RNA spremeni Razlika.

Opomba 3Ostanki snovi

Obstoj ostankov snovi bo vplival na točnost merjenja koncentracije nukleinske kisline, zato se je treba čim bolj izogibati ostankom beljakovin, fenolov, polisaharidov in polifenolov v vzorcih nukleinskih kislin.

Vendar pa je v resnici ekstrakcija z organskimi reagenti stara metoda.V komercialnih kompletih je mogoče učinek ekstrakcije doseči z adsorpcijsko kolono na osnovi silicijevega dioksida v kombinaciji s centrifugiranjem, s čimer se izognemo strupenim in škodljivim organskim reagentom, ki jih je težko odstraniti itd. Težava, kot je npr.Foregeneov komplet za ekstrakcijo nukleinske kisline, ne uporablja DNaze/RNaze in strupenih organskih reagentov med celotno operacijo, hitro in varno, inučinek jedobro(po nesreči je rekel, da je plešast, vendar vem, da želite vedeti).

Primer 1: Izkoristek in čistost ekstrakcije genomske DNA

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) obdela vzorce tal iz različnih virov, količina in čistost pridobljene genomske DNA pa sta prikazani v naslednji tabeli:
Primer 2: Izkoristek in čistost ekstrakcije tkivne RNA

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) je obdelal različne vzorce tkiv, količina in čistost pridobljene RNA pa sta prikazani v spodnji tabeli (za mišje tkivo):
Vendar ne mislite, da ste končali z vrednostjo OD.Ali imate kaj, da poskrbite za ključne točke, ki sem vam jih narisal spredaj?

Opaziti

V absorbanci bodo izračunane tudi fragmentirane molekule nukleinske kisline.Ob predpostavki, da imate ostanke genomske DNA v RNA, bo vaša vrednost OD videti zelo visoka, vendar dejanske koncentracije RNA ni mogoče določiti.Ali je vaša RNA. Ni jasno, ali je prišlo do razgradnje, zato še vedno potrebujemo celovito metodo vrednotenja za natančnejšo presojo, to je oceno integritete nukleinske kisline, omenjeno v MIQE.