Tradicionalne reverzne transkriptaze ne prenesejo visokih temperatur (optimalna temperatura za aktivnost MMLV je 37-50 °C, AMV pa 42-60 °C).Bolj kompleksne virusne RNA ni mogoče učinkovito reverzno prepisati v cDNA pri nizkih temperaturah, kar povzroči zmanjšanje učinkovitosti zaznavanja.Tradicionalni RT-qPCR na splošno zahteva sodelovanje dveh ključnih encimov (reverzne transkriptaze in DNA polimeraze), zaradi česar ni mogoče poenostaviti delovanja reakcijskega sistema in znižati stroškov.Tukaj bomo predstavili dve reverzni transkriptazi, odporni na visoke temperature, TtH in RevTaq.Ta dva encima imata tudi funkcijo DNA polimeraze, zato ju imenujemo bifunkcionalna encima.

TtH DNA polimeraza

Gotovo ste že slišali za TtH, ki je pridobljen iz termofilne bakterije Thermus thermophilus HB8.V prisotnosti dvovalentnih kationov, kot je Mg2+, ima aktivnost DNA polimeraze.Široko se uporablja v reakcijah PCR, kot je encim Taq, vendar ima večjo toplotno odpornost kot encim Taq, zato ima tudi boljši učinek na PCR s šablonami z visoko vsebnostjo GC.

· Ta encim v bistvu nima 3′→5′ eksonukleazne aktivnosti in 5′→3' eksonukleazne aktivnosti, zato se lahko uporablja tudi za dideoksi sekvenciranje.

· Ta encim ima aktivnost RTase.V prisotnosti Mn2+ se aktivnost RTase poveča.Z uporabo te funkcije se lahko uporablja za izvedbo reakcije reverzne transkripcije in reakcije PCR v isti epruveti, to je enostopenjski RT-PCR.Vendar pa v prisotnosti Mn2+ natančnost RT-PCR ni visoka.Aktivnost RT nima nobene zveze z aktivnostjo rnaze H.

· Povečana aktivnost Tth-DNA polimeraze (pH9, optimalno +55℃～+70℃, največ +95℃) premaga težave, ki jih povzroča sekundarna struktura RNA.Nastalo cDNA lahko pomnožimo s PCR z istim encimom v prisotnosti Mg2+ ionov.

· Sposobnost polimeraze Tth-DNA, da izvaja reverzno transkripcijo in pomnoževanje DNA pri visokih temperaturah, naredi ta encim uporaben za kvantitativno RT-PCR, kloniranje in analizo genske ekspresije celične in virusne RNA.
· Tth-DNA polimeraza se uporablja za RT-PCR za pomnoževanje RNA do 1kb.

Lastnosti in prednosti

Tth DNA polimeraza:

• Zagotovite optimizirano velikost produkta verižne reakcije s polimerazo (PCR), vsaj 1000 bp v reakciji RT-PCR

• Sprejmite modificiran deoksiribonukleozid trifosfat kot substrat

• Ni povezano z aktivnostjo RNaze H

• Ima visoko toplotno stabilnost za premagovanje težav, ki so običajno povezane z visoko sekundarno strukturo, prisotno v RNA

RevTaq RT-PCR DNA polimeraza

Toplotno odporna DNA polimeraza z aktivnostjo reverzne transkriptaze

RevTaq-RT-PCR-DNA polimeraza je zasnovan, zelo toplotno odporen, dvojno funkcionalni encim z aktivnostmi reverzne transkriptaze in DNA polimeraze, pridobljen z usmerjeno in umetno evolucijo.

· Razpolovni čas RevTaq RT-PCR DNA polimeraze pri 95 °C je daljši od 40 minut.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraza omogoča visokotemperaturno reverzno transkripcijo neposredno iz RNA šablone, korak reverzne transkripcije pa je mogoče večkrat ponoviti, da se ustvari več cDNA šablon.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraza omogoča RT-PCR z ničelnim korakom (brez izotermnega koraka reverzne transkripcije), ker se v koraku podaljšanja ciklične PCR reverzna transkripcija in pomnoževanje DNA zgodita sočasno.To prav tako spodbuja reakcijo povratne transkripcije pri visokih temperaturah, s čimer se zmanjšajo težave, ki nastanejo pri taljenju močne sekundarne strukture v RNA pri visokih temperaturah.

· Zaradi formule za vroč zagon na osnovi aptamerja bo RevTaq RT-PCR DNA polimeraza dosegla boljše rezultate, ko bo temperatura žarjenja in podaljšanja višja od 57 °C.

· Ker je encim odporen na vročino, je priporočljivo oblikovati primerje in sonde z zelo visokimi tališči (>60°C).

· Priporočljivo je optimizirati temperaturo koraka žarjenja/podaljšanja s temperaturnim gradientom med postopkom nastavitve reakcije.

· Višja kot je temperatura, večja je specifičnost PCR.Cikel reverzne transkripcije se običajno izvaja pri višji temperaturi kot cikel PCR, ker ima hibridizacija DNA Primer:RNK Template običajno višje tališče kot DNA Primer:cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraza je gensko spremenjena in optimizirana, velikost pomnožkov pa je med 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR meja zaznavanja DNA polimeraze doseže 4 kopije/

Optimiziran reakcijski sistem (vzpostavitev primerjev z visokim tališčem) je prikazan na sliki.RevTaq RT-PCR RT-PCR, ki ga poganja DNA polimeraza, kaže boljšo občutljivost kot glavna mešanica TaqPath v 1 koraku RT-qPCR in nižji gradient razredčitve vzorca zaznavanja.

Več prednosti:

Funkcija hitrega zagona → Začetni korak toplotne denaturacije lahko preskočite.

Aptamer formula za vroč zagon → Takoj zagotovi 100-odstotno encimsko aktivnost in prepreči nespecifično pomnoževanje pri nizkih temperaturah (<57°C).

Funkcija cepitve → Korak ekstrakcije RNA je izpuščen, ker RevTaq RT-PCR DNA polimeraza lahko obdela tudi surove reakcijske vzorce.Takoj lahko uniči celične membrane evkariontov, bakterij in virusov v vročem ciklu RT-PCR.

Raven surovin IVD → visoki standardi kakovosti in izjemno konkurenčne cene