• PCR je metoda, ki se uporablja za pomnoževanje DNK iz majhne količine predloge DNK.RT-PCR uporablja reverzno transkripcijo za izdelavo predloge DNK iz vira RNK, ki jo je nato mogoče pomnožiti.
• PCR in RT-PCR sta običajno končni reakciji, medtem ko qPCR in RT-qPCR uporabljata kinetiko hitrosti sinteze produkta med reakcijo PCR za kvantificiranje količine prisotne matrice.
• Novejše metode, kot je digitalni PCR, zagotavljajo absolutno kvantifikacijo začetne predloge DNK, medtem ko metode, kot je izotermični PCR, zmanjšujejo potrebo po dragi opremi za zagotavljanje zanesljivih rezultatov.

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je razmeroma preprosta in široko uporabljena tehnika molekularne biologije za pomnoževanje in odkrivanje zaporedij DNA in RNA.V primerjavi s tradicionalnimi metodami kloniranja in pomnoževanja DNK, ki lahko pogosto trajajo dneve, PCR zahteva le nekaj ur.PCR je zelo občutljiv in zahteva minimalno šablono za odkrivanje in pomnoževanje specifičnih zaporedij.Osnovne metode PCR so od preproste detekcije DNK in RNK še napredovale.Spodaj smo podali pregled različnih metod PCR in reagentov, ki jih nudimo pri Enzo Life Sciences za vaše raziskovalne potrebe.Znanstvenikom želimo pomagati do hitrega dostopa do reagentov PCR, ki jih bodo lahko uporabili v svojem naslednjem raziskovalnem projektu!

PCR

Za standardni PCR potrebujete le DNA polimerazo, magnezij, nukleotide, primerje, predlogo DNA za pomnoževanje in termocikler.Mehanizem PCR je tako preprost kot njegov namen: 1) dvoverižna DNA (dsDNA) je toplotno denaturirana, 2) primerji se poravnajo z enojnimi verigami DNA in 3) primerji se podaljšajo z DNA polimerazo, kar povzroči dve kopiji izvirna veriga DNK.Proces denaturacije, žarjenja in raztezanja v nizu temperatur in časov je znan kot en cikel ojačanja (slika 1).

Vsak korak cikla mora biti optimiziran za uporabljeno predlogo in temeljni nabor.Ta cikel se ponovi približno 20- do 40-krat, pomnoženi produkt pa se nato lahko analizira, običajno z agaroznim gelom (slika 2).

Ker je PCR zelo občutljiva metoda in so za posamezne reakcije potrebne zelo majhne količine, je priporočljiva priprava glavne mešanice za več reakcij.Glavno mešanico je treba dobro premešati in nato razdeliti na število reakcij, pri čemer je treba zagotoviti, da bo vsaka reakcija vsebovala enako količino encima, dNTP in primerjev.Številni dobavitelji, kot je Enzo Life Sciences, ponujajo tudi mešanice PCR, ki že vsebujejo vse razen primerjev in predloge DNK.

Regije, bogate z gvaninom/citozinom (GC-rich), predstavljajo izziv pri standardnih tehnikah PCR.Sekvence, bogate z GC, so stabilnejše od sekvenc z nižjo vsebnostjo GC.Poleg tega zaporedja, bogata z GC, ponavadi tvorijo sekundarne strukture, kot so zanke za lase.Posledično je dvojne verige, bogate z GC, težko popolnoma ločiti med fazo denaturacije.Posledično DNA polimeraza ne more brez ovir sintetizirati nove verige.Višja temperatura denaturacije lahko to izboljša, prilagoditve v smeri višje temperature žarjenja in krajšega časa žarjenja pa lahko preprečijo nespecifično vezavo primerjev, bogatih z GC.Dodatni reagenti lahko povečajo pomnoževanje zaporedij, bogatih z GC.DMSO, glicerol in betain pomagajo razbiti sekundarne strukture, ki jih povzročajo interakcije GC, in s tem olajšajo ločevanje dvojnih verig.

Hot Start PCR

Nespecifična amplifikacija je težava, ki se lahko pojavi med PCR.Večina DNA polimeraz, ki se uporabljajo za PCR, najbolje deluje pri temperaturah okoli 68 °C do 72 °C.Encim pa je lahko aktiven tudi pri nižjih temperaturah, čeprav v manjši meri.Pri temperaturah, ki so daleč pod temperaturo žarjenja, se lahko primerji nespecifično vežejo in povzročijo nespecifično pomnoževanje, tudi če je reakcija postavljena na ledu.To lahko preprečimo z uporabo zaviralcev polimeraze, ki disociirajo od DNA polimeraze šele, ko je dosežena določena temperatura, od tod tudi izraz vroč zagon PCR.Zaviralec je lahko protitelo, ki veže polimerazo in denaturira pri začetni temperaturi denaturacije (običajno 95 °C).

Polimeraza visoke ločljivosti

Medtem ko se polimeraze DNA dokaj natančno pomnožijo na prvotno zaporedje predloge, lahko pride do napak pri ujemanju nukleotidov.Neujemanja v aplikacijah, kot je kloniranje, lahko povzročijo okrnjene transkripte in napačno prevedene ali neaktivne beljakovine v smeri toka.Da bi se izognili tem neskladjem, so bile identificirane polimeraze z aktivnostjo »lektoriranja« in vključene v potek dela.Prva lektorska polimeraza, Pfu, je bila identificirana leta 1991 pri Pyrococcus furiosus.Ta encim Pfu ima 3' do 5' eksonukleazno aktivnost.Ko se DNK pomnoži, eksonukleaza odstrani neujemajoče se nukleotide na 3' koncu verige.Pravilni nukleotid se nato nadomesti in sinteza DNK se nadaljuje.Identifikacija nepravilnih nukleotidnih zaporedij temelji na afiniteti vezave pravilnega nukleozid trifosfata z encimom, kjer neučinkovita vezava upočasni sintezo in omogoči pravilno zamenjavo.Lektorska aktivnost Pfu polimeraze povzroči manj napak v končnem zaporedju v primerjavi s Taq DNA polimerazo.V zadnjih letih so bili identificirani drugi encimi za lektoriranje in narejene so bile modifikacije izvirnega encima Pfu, da bi še dodatno zmanjšali stopnjo napak med pomnoževanjem DNA.

RT-PCR

PCR z reverzno transkripcijo ali RT-PCR omogoča uporabo RNA kot predloge.Dodaten korak omogoča odkrivanje in pomnoževanje RNA.RNA se reverzno prepiše v komplementarno DNA (cDNA) z uporabo reverzne transkriptaze.Kakovost in čistost predloge RNA sta bistveni za uspeh RT-PCR.Prvi korak RT-PCR je sinteza hibrida DNA/RNA.Reverzna transkriptaza ima tudi funkcijo RNaze H, ki razgradi del RNA hibrida.Molekulo enoverižne DNK nato dopolni DNK-odvisna polimerazna aktivnost reverzne transkriptaze v cDNK.Učinkovitost reakcije prve verige lahko vpliva na proces pomnoževanja.Od tu naprej se za pomnoževanje cDNA uporablja standardni postopek PCR.Možnost pretvorbe RNA v cDNA z RT-PCR ima veliko prednosti in se uporablja predvsem za analizo izražanja genov.RNA je enoverižna in zelo nestabilna, zato je z njo težko delati.Običajno služi kot prvi korak v qPCR, ki kvantificira transkripte RNK v biološkem vzorcu.

qPCR in RT-qPCR

Kvantitativna PCR (qPCR) se uporablja za odkrivanje, karakterizacijo in kvantifikacijo nukleinskih kislin za številne aplikacije.Pri RT-qPCR se transkripti RNA pogosto kvantificirajo tako, da se najprej reverzno prepišejo v cDNA, kot je opisano zgoraj, nato pa se izvede qPCR.Tako kot pri standardni PCR se DNK pomnoži s tremi ponavljajočimi se koraki: denaturacijo, žarjenjem in elongacijo.Vendar pa pri qPCR fluorescentno označevanje omogoča zbiranje podatkov, ko PCR napreduje.Ta tehnika ima veliko prednosti zaradi vrste razpoložljivih metod in kemikalij.

Pri qPCR na osnovi barvila (običajno zelenega) fluorescentno označevanje omogoča kvantifikacijo pomnoženih molekul DNA z uporabo barvila, ki veže dsDNA.Med vsakim ciklom se meri fluorescenca.Signal fluorescence narašča sorazmerno s količino podvojene DNA.Zato je DNK kvantificirana v "realnem času" (slika 3).Slabosti qPCR na osnovi barvila so, da je mogoče naenkrat pregledati le eno tarčo in da se bo barvilo vezalo na katero koli ds-DNA, prisotno v vzorcu.

Pri qPCR na osnovi sonde je mogoče v vsakem vzorcu hkrati zaznati veliko tarč, vendar je za to potrebna optimizacija in oblikovanje sonde, specifične za tarčo, ki se uporablja poleg primerjev.Na voljo je več tipov sond, vendar je najpogostejši tip sonde za hidrolizo, ki vključuje fluorofor in dušilec.Prenos fluorescenčne resonančne energije (FRET) preprečuje oddajanje fluoroforja skozi dušilec, medtem ko je sonda nedotaknjena.Vendar se med reakcijo PCR sonda hidrolizira med podaljševanjem primerja in pomnoževanjem specifičnega zaporedja, na katerega je vezana.Cepitev sonde loči fluorofor od dušilca ​​in povzroči od ojačanja odvisno povečanje fluorescence (slika 4).Tako je fluorescenčni signal iz reakcije qPCR na osnovi sonde sorazmeren s količino ciljnega zaporedja sonde, prisotnega v vzorcu.Ker je qPCR na osnovi sonde bolj specifičen kot qPCR na osnovi barvila, je to tehnologija pogosto uporabljena v diagnostičnih testih na osnovi qPCR.

Izotermno ojačanje

Zgoraj omenjene tehnike PCR zahtevajo drago termociklirno opremo za natančno povečevanje in zniževanje temperatur v komori za korake denaturacije, žarjenja in podaljšanja.Razvite so bile številne tehnike, ki ne potrebujejo tako natančnih naprav in jih je mogoče izvajati v preprosti vodni kopeli ali celo v celicah, ki nas zanimajo.Te tehnike se skupaj imenujejo izotermno ojačanje in delujejo na podlagi eksponentnega, linearnega ali kaskadnega ojačanja.

Najbolj znana vrsta izotermnega ojačanja je izotermno ojačanje z zanko ali LAMP.LAMP uporablja eksponentno pomnoževanje pri 65⁰C za pomnoževanje šablonske DNK ali RNK.Pri izvajanju LAMP se za sintetiziranje nove DNA uporabi štiri do šest primerjev, ki so komplementarni regijam ciljne DNA, z DNA polimerazo.Dva od teh primerjev imata komplementarni sekvenci, ki prepoznata sekvence v drugih primerjih in ju vežeta, kar omogoča, da se v novo sintetizirani DNK oblikuje struktura "zanke", ki nato pomaga pri žarjenju primerja v naslednjih krogih pomnoževanja.LAMP je mogoče vizualizirati z več metodami, vključno s fluorescenco, elektroforezo v agaroznem gelu ali kolorimetrijo.Enostavnost vizualizacije in odkrivanja prisotnosti ali odsotnosti izdelka s kolorimetrijo ter pomanjkanje potrebne drage opreme je naredila LAMP primerno možnost za testiranje SARS-CoV-2 na območjih, kjer klinično laboratorijsko testiranje ni bilo na voljo, ali shranjevanje in transport vzorcev ni bilo izvedljivo ali v laboratorijih, ki prej niso imeli opreme za termocikliranje PCR.