Osnovna zasnova primerja (99 % težav je mogoče rešiti)
1. Dolžina primerja: učbenik zahteva 15-30 bp, običajno približno 20 bp.Dejansko stanje je bolje, če je 18-24 bp, da se zagotovi specifičnost, vendar dlje, tem bolje, predolg primer bo prav tako zmanjšal specifičnost in zmanjšal donos.
2. Razpon pomnoževanja primerja: primerno je 200–500 bp, fragment pa je mogoče pod posebnimi pogoji razširiti na 10 kb.
3. Osnovna osnova: vsebnost G+C mora biti 40-60 %, premajhen učinek ojačanja G+C ni dober, preveč G+C zlahka povzroči nespecifične pasove.ATGC je najbolje porazdeliti naključno, pri čemer se izogibajte skupinam več kot 5 purinskih ali pirimidinskih nukleotidov.Multi-gc za 5' konec in vmesna zaporedja za povečanje stabilnosti, izogibajte se bogatemu GC na 3' koncu, brez GC za zadnje 3 baze ali brez GC za 3 od zadnjih 5 baz.
4. Izogibajte se sekundarni strukturi v primerjih in izogibajte se komplementaciji med dvema primerjema, zlasti komplementaciji na 3' koncu, sicer bo nastal dimer primerja in nastali bodo nespecifični pomnoženi pasovi.
5. Baze na 3' koncu začetnih baz, zlasti zadnja in predzadnja baza, morajo biti strogo seznanjene, da se prepreči neuspeh PCR zaradi neparnih končnih baz.
6. Primerji imajo ali se lahko dodajo z ustreznimi cepitvenimi mesti, pomnoženo ciljno zaporedje pa mora po možnosti imeti ustrezna cepitvena mesta, kar je zelo koristno za analizo cepitve ali molekularno kloniranje.
7. Specifičnost začetnih začetkov: primerji ne smejo imeti očitne homologije z drugimi zaporedji v zbirki podatkov o zaporedjih nukleinskih kislin.
8. Naučite se uporabljati programsko opremo: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (ta spletna oblika deluje najbolje).
Zgornja vsebina lahko reši vsaj 99 % problemov oblikovanja temeljnega premaza.
Nadzirajte podrobnosti oblikovanja temeljnega premaza
1. Dolžina temeljnega premaza
Splošna dolžina primerja je 18~30 baz.Na splošno je najpomembnejši dejavnik, ki določa temperaturo žarjenja temeljnega premaza, dolžina temeljnega premaza.Temperatura žarjenja primerja je na splošno izbrana (vrednost Tm -5 ℃), nekateri pa neposredno uporabljajo vrednost Tm.Za približen izračun temperature žarjenja primerjev lahko uporabite naslednje formule.
Ko je dolžina primerja manjša od 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5 ℃
Ko je dolžina primerja večja od 20 bp: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (%GC) -500/dolžina -5 ℃
Poleg tega se lahko za izračun temperature žarjenja uporabi tudi veliko programske opreme, načelo izračuna bo drugačno, zato ima lahko izračunana vrednost včasih majhno vrzel.Za optimizacijo reakcij PCR se za najboljšo učinkovitost in specifičnost uporabljajo najkrajši primerji, ki zagotavljajo temperature žarjenja najmanj 54 ℃.
Na splošno se specifičnost primerja poveča za faktor štiri za vsak dodatni nukleotid, tako da je najmanjša dolžina primerja za večino aplikacij 18 nukleotidov.Zgornja meja dolžine primerja ni zelo pomembna, povezana je predvsem z učinkovitostjo reakcije.Zaradi entropije daljši kot je primer, nižja je hitrost, pri kateri se žari, da se veže na ciljno DNA, da tvori stabilno dvoverižno matrico za vezavo DNA polimeraze.
Pri uporabi programske opreme za načrtovanje primerjev je mogoče dolžino primerjev določiti z vrednostjo TM po vrsti, zlasti za primerje fluorescenčne kvantitativne PCR je treba nadzorovati TM=60 ℃ ali tako.
2. Vsebina GC
Na splošno je vsebnost G+C v sekvencah primerjev 40 %~60 %, vsebnost GC in vrednost Tm para primerjev pa morata biti usklajeni.Če ima osnovni premaz A resno tendenco GC ali AT, lahko na 5' konec primerja dodamo ustrezno količino A, T ali G in C repa.
3. Temperatura žarjenja
Temperatura žarjenja mora biti 5 ℃ nižja od temperature brez verige.Če je število začetnih baz majhno, se lahko temperatura žarjenja ustrezno poveča, kar lahko poveča specifičnost PCR.Če je število baz veliko, lahko temperaturo žarjenja ustrezno znižamo.Temperaturna razlika pri žarjenju med parom primerjev 4 ℃ ~ 6 ℃ ne bo vplivala na izkoristek PCR, vendar je v idealnem primeru temperatura žarjenja para primerjev enaka, kar lahko variira med 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Izogibajte se območju sekundarne strukture šablone za ojačanje
Pri izbiri ojačanega fragmenta se je najbolje izogniti predelu sekundarne strukture šablone.Stabilno sekundarno strukturo ciljnega fragmenta je mogoče predvideti in oceniti z ustrezno računalniško programsko opremo, ki je v pomoč pri izbiri predloge.Eksperimentalni rezultati kažejo, da je ekspanzija pogosto neuspešna, če je prosta energija (△G) območja, ki ga je treba razširiti, manjša od 58,6 lkJ/mol.
5. Neujemanje s ciljno DNA
Kadar je pomnoženo ciljno zaporedje DNK veliko, se lahko primer veže na več delov ciljne DNK, kar povzroči, da se v rezultatu pojavi več trakov.Tokrat je potrebno uporabiti testiranje programske opreme BLAST, spletno mesto:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Izberite Poravnaj dve zaporedji (bl2seq).
Lepljenje začetnih zaporedij v cono 1 in ciljnih zaporedij DNK v cono 2 je zamenljivo, BLAST pa izračuna komplementarne, protismiselne in druge možnosti, tako da uporabnikom ni treba opaziti, ali sta obe verigi smiselni verigi.Vnesete lahko tudi številko GI, če poznate številko GI zaporedja v zbirki podatkov, tako da vam ni treba prilepiti velikega dela zaporedja.Nazadnje kliknite Poravnaj na 3, da vidite, ali ima primer več homolognih mest v ciljni DNK.
6. Primerni terminal
Konec 3 'primerja je kraj, kjer se začne podaljšek, zato je pomembno preprečiti, da bi se neujemanja začela tam.Konec 3' ne sme biti več kot 3 zaporedne G ali C, ker bo to povzročilo pomotoma sprožitev primerja v območju obogatitvenega zaporedja G+C.3'-konec ne more tvoriti nobene sekundarne strukture, razen v posebnih reakcijah PCR (AS-PCR), 3'-konca primerja ni mogoče napačno ujemati.Na primer, če je kodirno območje pomnoženo, se 3'-konec primerja ne sme končati na tretjem položaju kodona, ker je tretji položaj kodona nagnjen k degeneraciji, kar bo vplivalo na specifičnost in učinkovitost pomnoževanja.Pri uporabi primerjev za aneksijo si oglejte tabelo uporabe kodona, bodite pozorni na biološke preference, ne uporabljajte primerjev za aneksijo na 3' koncu in uporabite višjo koncentracijo primerjev (1uM-3uM).
7. Sekundarna struktura začetnih premazov
Primerji sami ne bi smeli imeti komplementarnih zaporedij, sicer se bodo sami primerji zvili v lasne strukture, ta sekundarna struktura pa bo vplivala na vezavo primerjev in predlog zaradi steričnih ovir.Če se uporabi umetna presoja, zvezne komplementarne baze samih primerjev ne smejo biti večje od 3 bp.Med obema primerjema ne sme biti komplementarnosti, še posebej se je treba izogibati komplementarnemu prekrivanju 3' konca, da preprečimo nastanek dimerjev primerja.Na splošno ne sme biti več kot 4 zaporednih baz homolognih ali komplementarnih med parom začetnih oligonulatorjev.
8. Dodajte oznake ali lokuse
5'-konec ima majhen učinek na specifičnost pomnoževanja in ga je zato mogoče spremeniti brez vpliva na specifičnost pomnoževanja.Modifikacija primerja 5' konca je vključevala: dodajanje encimskega restrikcijskega mesta;Označen biotin, fluorescenca, digoksin, Eu3+ itd. Predstavite zaporedja DNA, ki vežejo beljakovine;Uvedba mutacijskih mest, vstavljanje in manjkajoče mutacijske sekvence in uvedba promotorskih sekvenc itd. Dodatne baze bodo bolj ali manj vplivale na učinkovitost pomnoževanja in povečale možnost tvorbe dimerja primerja, vendar je treba za naslednji korak narediti nekaj popustov.Dodatne sekvence, ki ne obstajajo na ciljni sekvenci, kot so restrikcijska mesta in promotorske sekvence, se lahko dodajo na 5' konec primerja, ne da bi to vplivalo na specifičnost.Ta zaporedja niso vključena v izračun vrednosti Tm primerja, vendar jih je treba testirati glede komplementarnosti in notranje sekundarne strukture.
9. Podkloni
Večino časa je PCR le predhodno kloniranje, nato pa moramo ciljni fragment subklonirati v različne vektorje, zato moramo oblikovati dodatne baze za naslednjo operacijo v koraku PCR.
Nekatere sekvence, zasnovane za subkloniranje, so povzete spodaj.
Dodano je bilo restrikcijsko mesto restrikcijske endonukleaze
Dodajanje encimskih restrikcijskih mest je najpogosteje uporabljena metoda za subkloniranje produktov PCR.Na splošno je mesto cepitve šest baz, poleg 5' konca mesta cepitve je treba dodati 2 ~ 3 zaščitne baze.Vendar je število zaščitnih baz, ki jih potrebujejo različni encimi, različno.Na primer, SalⅠ ne potrebuje zaščitne podlage, EcoRⅤ zahteva 1 zaščitno podlago, NotⅠ zahteva 2 zaščitni podlagi in Hind Ⅲ zahteva 3 zaščitne podlage.
LIC dodaja rep
Polno ime LIC je Ligation-Independent cloning, metoda kloniranja, ki jo je izumil Navogen posebej za svoj del vektorja pET.Nosilec pET, pripravljen z metodo LIC, ima nekomplementarne lepljive konce z enojno nitjo 12-15 baz, ki dopolnjujejo ustrezne lepljive konce na ciljnem fragmentu vložka.Za namene pomnoževanja mora zaporedje 5' primerja vstavljenega fragmenta dopolnjevati vektor LIC.Ekstranektna aktivnost 3′→5′ T4 DNA polimeraze lahko po kratkem času na vstavljenem fragmentu tvori lepljivi konec z eno verigo.Ker lahko produkt nastane le z medsebojnim žarjenjem pripravljenega fragmenta vložka in vektorja, je ta metoda zelo hitra in učinkovita, gre pa za usmerjeno kloniranje.
Usmerjeni TA klon doda rep
Kloniranje TA ni moglo usmeriti fragmenta v vektor, zato je kasneje Invitrogen uvedel vektor, ki je lahko ciljal na kloniranje in je vseboval štiri vidne baze GTGGS na enem koncu.Zato je treba pri načrtovanju primerjev za PCR ustrezno dodati komplementarna zaporedja, tako da se fragmenti lahko "orientirajo".
Če vam primanjkuje časa, lahko poskusite neposredno sintezo, kombiniranje gena z vektorjem, čemur pri muzekularci pravimo sinteza gena ET.
D. Metoda kloniranja In-Fusion
Ni potrebna ligaza, ni potrebna dolga reakcija.Dokler je pri načrtovanju primerjev uvedeno zaporedje na obeh koncih lineariziranega vektorja, nato pa se produkt PCR in linearizirani vektor doda v raztopino fuzijskega encima, ki vsebuje BSA, in postavi na sobno temperaturo za pol ure, se lahko izvede transformacija.Ta metoda je še posebej primerna za pretvorbo velikih količin.
10. Primer za spajanje
Včasih so o zasnovi primerja znane le omejene informacije o zaporedju.Na primer, če je znano samo aminokislinsko zaporedje, je mogoče oblikovati spojni primer.Združitveni primer je mešanica različnih zaporedij, ki predstavljajo vse različne možnosti baz, ki kodirajo eno samo aminokislino.Če želite povečati specifičnost, se lahko obrnete na tabelo uporabe kodona, da zmanjšate aneksijo glede na preference glede osnovne uporabe različnih organizmov.Hipoksantin lahko združimo z vsemi bazami, da zmanjšamo temperaturo žarjenja temeljnega premaza.Ne uporabljajte priloženih baz na 3' koncu primerja, ker je žarjenje zadnjih 3 baz na 3' koncu zadostno za sprožitev PCR na napačnem mestu.Uporabljajo se višje koncentracije primerjev (1 μM do 3 μM), ker primerji v mnogih mešanicah za priključitev niso specifični za ciljno predlogo.
PCR surovinenadzor
1. Količina temeljnega premaza
Koncentracija vsakega primerja je 0,1 ~ 1 umol ali 10 ~ 100 pmol.Bolje je doseči želeni rezultat z najmanjšo količino primerja.Visoka koncentracija primerja bo povzročila neujemanje in nespecifično pomnoževanje ter povečala možnost tvorbe dimerjev med primerji.
2. Koncentracija primerja
Koncentracija primerjev vpliva na specifičnost.Optimalna koncentracija primerja je na splošno med 0,1 in 0,5 μM.Višje koncentracije primerjev vodijo do pomnoževanja nespecifičnih produktov.
3. Temperatura žarjenja primerja
Drug pomemben parameter za temeljne premaze je temperatura taljenja (Tm).To je temperatura, ko je 50 % primerjev in komplementarnih zaporedij predstavljenih kot dvoverižne molekule DNA.Tm je potreben za nastavitev temperature žarjenja PCR.V idealnem primeru je temperatura žarjenja dovolj nizka, da zagotovi učinkovito žarjenje primerjev s ciljnim zaporedjem, vendar dovolj visoka, da zmanjša nespecifično vezavo.Razumna temperatura žarjenja od 55 ℃ do 70 ℃.Temperatura žarjenja je na splošno nastavljena 5 ℃ nižje od Tm temeljnega premaza.
Obstaja več formul za nastavitev Tm, ki se zelo razlikujejo glede na uporabljeno formulo in zaporedje primerjev.Ker večina formul zagotavlja ocenjeno vrednost Tm, so vse temperature žarjenja le izhodišče.Specifičnost je mogoče izboljšati z analizo več reakcij, ki postopoma zvišujejo temperaturo žarjenja.Začnite pod ocenjeno Tm-5 ℃ in postopoma povečajte temperaturo žarjenja v korakih po 2 ℃.Višja temperatura žarjenja bo zmanjšala tvorbo dimerjev primerjev in nespecifičnih produktov.Za najboljše rezultate morata oba primerja imeti približne vrednosti Tm.Če je razlika Tm parov primerjev večja od 5 ℃, bodo primerji pokazali pomemben napačen začetek z uporabo nižje temperature žarjenja v ciklu.Če sta primerja Tm različna, temperaturo žarjenja nastavite na 5 ℃ nižje od najnižje Tm.Druga možnost je, da se poveča specifičnost, najprej izvede pet ciklov pri temperaturah žarjenja, zasnovanih za višje Tm, čemur sledijo preostali cikli pri temperaturah žarjenja, zasnovanih za nižje Tm.To omogoča pridobitev delne kopije ciljne predloge pod tesnimi pogoji.
4. Čistost in stabilnost primerja
Standardna čistost primerjev po meri je primerna za večino aplikacij PCR.Odstranitev benzoilnih in izobutililnih skupin z razsoljevanjem je minimalna in zato ne moti PCR.Nekatere aplikacije zahtevajo čiščenje, da se v procesu sinteze odstranijo zaporedja, ki niso v polni dolžini.Do teh okrnjenih zaporedij pride, ker učinkovitost kemije sinteze DNK ni 100-odstotna.To je krožni proces, ki uporablja ponavljajoče se kemijske reakcije, ko se doda vsaka baza, da nastane DNK od 3' do 5'.V obeh ciklih lahko spodletiš.Daljši primerji, zlasti tisti, ki imajo več kot 50 baz, imajo velik delež skrajšanih zaporedij in lahko zahtevajo čiščenje.
Na izkoristek primerjev vplivata učinkovitost sintetične kemije in metode čiščenja.Biofarmacevtska podjetja, kot sta Cytology in Shengong, vsa uporabljajo minimalno enoto OD, da zagotovijo celotno proizvodnjo oligonukleozida.Primerji po meri se pošiljajo v obliki suhega prahu.Najbolje je, da primerje ponovno raztopite v TE, tako da je končna koncentracija 100 μM.TE je boljši od deionizirane vode, ker je pH vode pogosto kisel in bo povzročil hidrolizo oligonukleozidov.
Stabilnost temeljnih premazov je odvisna od pogojev skladiščenja.Suh prašek in raztopljene primerje je treba hraniti pri -20 ℃.Primerje, raztopljene v TE pri koncentracijah, večjih od 10 μM, je mogoče stabilno shraniti pri -20 ℃ 6 mesecev, vendar jih je mogoče shraniti le pri sobni temperaturi (15 ℃ do 30 ℃) manj kot 1 teden.Suhe praškaste temeljne premaze lahko hranite pri -20 C vsaj 1 leto in pri sobni temperaturi (15 C do 30 C) do 2 meseca.
5. Encimi in njihove koncentracije
Trenutno je uporabljena DNA polimeraza Taq v bistvu encim genskega inženiringa, ki ga sintetizirajo koliformne bakterije.Količina encima, ki je potrebna za kataliziranje tipične reakcije PCR, je približno 2,5 U (nanaša se na skupni reakcijski volumen 100 ul).Če je koncentracija previsoka, lahko povzroči nespecifično ojačanje;če je koncentracija prenizka, se bo količina sintetičnega izdelka zmanjšala.
6. Kakovost in koncentracija dNTP
Kakovost dNTP je tesno povezana s koncentracijo in učinkovitostjo pomnoževanja PCR.Prašek dNTP je zrnat in njegova variabilnost izgubi svojo biološko aktivnost, če je nepravilno shranjen.Raztopina dNTP je kisla in jo je treba uporabiti v visoki koncentraciji, z 1M NaOH ali 1M raztopino pufra Tris.HCL, da prilagodite svoj PH na 7,0 ~ 7,5, majhna količina podembalaže, zamrznjeno shranjevanje pri -20 ℃.Večkratno zamrzovanje in odmrzovanje bo razgradilo dNTP.Pri reakciji PCR mora biti dNTP 50 ~ 200 umol/l.Še posebej je treba paziti, da mora biti koncentracija štirih DNTPS enaka (enaka molska priprava).Če je koncentracija katerega koli od njih drugačna od drugih (višja ali nižja), bo povzročeno neujemanje.Prenizka koncentracija bo zmanjšala izkoristek produktov PCR.dNTP se lahko poveže z Mg2+ in zmanjša koncentracijo prostega Mg2+.
7. Vzorčna (tarčni gen) nukleinska kislina
Količina in stopnja čiščenja šablonske nukleinske kisline je ena od ključnih povezav za uspeh ali neuspeh PCR.Tradicionalne metode čiščenja DNK običajno uporabljajo SDS in proteazo K za prebavo in odstranjevanje vzorcev.Glavne funkcije SDS so: raztapljanje lipidov in proteinov na celični membrani, s čimer uniči celično membrano z raztapljanjem membranskih proteinov in disociira jedrske proteine v celici, SDS se lahko tudi kombinira z beljakovinami in obori;Proteaza K lahko hidrolizira in prebavi beljakovine, zlasti histone, vezane na DNA, nato pa uporabi organsko topilo fenol in kloroform za ekstrakcijo beljakovin in drugih celičnih komponent ter uporabi etanol ali izopropilni alkohol za oborjenje nukleinske kisline.Ekstrahirano nukleinsko kislino lahko uporabimo kot matrico za reakcije PCR.Za vzorce splošnega kliničnega odkrivanja je mogoče uporabiti hitro in preprosto metodo za raztapljanje celic, liziranje patogenov, prebavo in odstranitev beljakovin iz kromosomov v proste ciljne gene ter neposredno uporabo za PCR pomnoževanje.Ekstrakcija šablone RNA običajno uporablja metodo z gvanidin izotiocianatom ali proteazo K, da prepreči, da bi RNaza razgradila RNA.
8. Koncentracija Mg2+
Mg2+ pomembno vpliva na specifičnost in izkoristek PCR pomnoževanja.Pri splošni reakciji PCR, ko je koncentracija različnih dNTP 200 umol/L, je ustrezna koncentracija Mg2+ 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Koncentracija Mg2+ je previsoka, specifičnost reakcije se zmanjša, pride do nespecifičnega pomnoževanja, prenizka koncentracija bo zmanjšala aktivnost Taq DNA polimeraze, kar bo povzročilo zmanjšanje reakcijskih produktov.
Magnezijevi ioni vplivajo na več vidikov PCR, kot je aktivnost DNA polimeraze, ki vpliva na donos;Drug primer je žarjenje primerja, ki vpliva na specifičnost.dNTP in matrica se vežeta na magnezijev ion, kar zmanjša količino prostega magnezijevega iona, potrebnega za encimsko aktivnost.Optimalna koncentracija magnezijevih ionov se razlikuje za različne pare primerjev in predloge, vendar je tipična začetna koncentracija PCR z 200 μM dNTP 1,5 mM (opomba: za kvantitativno PCR v realnem času uporabite 3 do 5 mM raztopino magnezijevih ionov s fluorescenčno sondo).Višje koncentracije prostih magnezijevih ionov povečajo izkoristek, vendar tudi povečajo nespecifično pomnoževanje in zmanjšajo natančnost.Za določitev optimalne koncentracije so bile izvedene titracije magnezijevih ionov v korakih po 0,5 mM od 1 mM do 3 mM.Za zmanjšanje odvisnosti od optimizacije magnezijevih ionov je mogoče uporabiti DNA polimerazo Platinum Taq.Platinum Taq DNA polimeraza lahko ohrani delovanje v širšem razponu koncentracij magnezijevih ionov kot Taq DNA polimeraza in zato zahteva manj optimizacije.
9. Dodatki za pospeševanje PCR
Optimizacija temperature žarjenja, zasnove temeljnega premaza in koncentracije magnezijevih ionov zadostuje za visoko specifično pomnoževanje večine predlog;vendar nekatere predloge, vključno s tistimi z visoko vsebnostjo GC, zahtevajo dodatne ukrepe.Dodatki, ki vplivajo na temperaturo taljenja DNK, so še en način za izboljšanje specifičnosti in izkoristka izdelka.Za najboljše rezultate je potrebna popolna denaturacija predloge.
Poleg tega sekundarna struktura preprečuje vezavo primerja in podaljšanje encima.
Dodatki za PCR, vključno s formamidom, DMSO, glicerinom, betainom in raztopino za izboljšanje PCRx, povečajo pomnoževanje.Njihov možen mehanizem je znižati temperaturo taljenja, s čimer pomaga pri žarjenju primerjev in pomaga pri razširitvi polimeraze DNA skozi regijo sekundarne strukture.Rešitev PCRx ima še druge prednosti.Pri uporabi z DNA polimerazo Platinum Taq in DNA polimerazo Platinum Pfx je potrebna minimalna optimizacija magnezijevih ionov.Tako je tehnika Platinum kombinirana z dodatkom za povečanje specifičnosti, hkrati pa zmanjša odvisnost od tretjega pristopa, optimizacije magnezijevih ionov.Za najboljše rezultate je treba optimizirati koncentracijo dodatkov, zlasti DMSO, formamida in glicerola, ki zavirajo Taq DNA polimerazo.
10. Vroči zagon
PCR z vročim zagonom je poleg dobre zasnove primerja ena najpomembnejših metod za izboljšanje specifičnosti PCR.Čeprav je optimalna temperatura raztezka Taq DNA polimeraze 72 ℃, polimeraza ostane aktivna pri sobni temperaturi.Tako nastanejo nespecifični produkti, ko je temperatura zadrževanja nižja od temperature žarjenja med pripravo reakcije PCR in na začetku termičnega cikla.Ko so enkrat oblikovani, se ti nespecifični produkti učinkovito povečajo.PCR z vročim zagonom je še posebej učinkovit, kadar so mesta, uporabljena za načrtovanje primerja, omejena z lokacijo genetskih elementov, kot so na mesto usmerjene mutacije, ekspresijsko kloniranje ali konstrukcija in manipulacija genetskih elementov, ki se uporabljajo za inženiring DNK.
Pogosta metoda za omejevanje aktivnosti Taq DNA polimeraze je priprava reakcijske raztopine PCR na ledu in postavitev v predhodno segret aparat za PCR.Ta metoda je preprosta in poceni, vendar ne zaključi aktivnosti encima in zato ne odpravi popolnoma pomnoževanja nespecifičnih produktov.
Toplotno pripravo upočasni sintezo DNK z zaviranjem bistvene komponente, dokler aparatura PCR ne doseže temperature denaturacije.Večina metod ročne toplotne iniciacije, vključno z zakasnjenim dodajanjem Taq DNA polimeraze, je okornih, zlasti pri aplikacijah z visoko zmogljivostjo.Druge metode termičnega premazovanja uporabljajo voščeni ščit za zapiranje bistvene komponente, vključno z magnezijevimi ioni ali encimi, ali za fizično izolacijo reaktivnih komponent, kot so predloge in pufri.Med termičnim ciklom se različne komponente sprostijo in pomešajo skupaj, ko se vosek tali.Tako kot metoda ročnega vročega zagona je tudi metoda zaščite z voskom okorna in nagnjena k kontaminaciji ter ni primerna za aplikacije z visoko zmogljivostjo.
Platinum DNA polimeraza je priročna in učinkovita za samodejni PCR z vročim zagonom.Platinum Taq DNA polimeraza je sestavljena iz rekombinantne Taq DNA polimeraze v kombinaciji z monoklonskim protitelesom proti Taq DNA polimerazi.Protitelesa so oblikovana s PCR za zaviranje aktivnosti encimov med dolgotrajnim vzdrževanjem temperature.Taq DNA polimeraza je bila sproščena v reakcijo med 94 ℃ izolacijo koraka denaturacije, s čimer se je ponovno vzpostavila polna aktivnost polimeraze.V nasprotju s kemično modificirano Taq DNA polimerazo za termično iniciacijo encim Platinum ne potrebuje dolgotrajne izolacije pri 94 ℃ (10 do 15 minut), da aktivira polimerazo.S PlatinumTaq DNA polimerazo je bilo 90 % aktivnosti Taq DNA polimeraze obnovljeno po 2 minutah pri 94 ℃.
11. Nest-PCR
Zaporedni krogi pomnoževanja z uporabo ugnezdenih primerjev lahko izboljšajo specifičnost in občutljivost.Prvi krog je standardna amplifikacija s 15 do 20 cikli.Majhen del začetnega produkta pomnoževanja je bil razredčen 100- do 1000-krat in dodan drugemu krogu pomnoževanja za 15 do 20 ciklov.Alternativno lahko začetni pomnoženi produkt dimenzioniramo s čiščenjem z gelom.V drugem krogu pomnoževanja se uporabi ugnezdeni primer, ki se lahko veže na ciljno zaporedje znotraj prvega primerja.Uporaba ugnezdene PCR zmanjša možnost pomnoževanja več ciljnih mest, ker je malo ciljnih zaporedij, ki komplementirajo obema nizoma primerjev.Enako skupno število ciklov (30 do 40) z enakimi primerji je pomnožilo nespecifična mesta.Ugnezdeni PCR poveča občutljivost omejenih ciljnih zaporedij (npr. redkih mrna) in izboljša specifičnost težavnega PCRS (npr. 5′ RACE).
12. Padajoči PCR
Padajoči PCR izboljša specifičnost z uporabo tesnih pogojev žarjenja za prvih nekaj ciklov PCR.Cikel se začne pri temperaturi žarjenja, ki je približno 5 ℃ višja od ocenjene Tm, nato se vsak cikel zmanjša za 1 ℃ do 2 ℃, dokler temperatura žarjenja ni pod Tm 5 ℃.Pomnožena bo samo ciljna predloga z najvišjo homologijo.Ti izdelki se v naslednjih ciklih še naprej širijo in izrinjajo okrepljene nespecifične izdelke.Padajoči PCR je uporaben za metode, pri katerih stopnja homologije med primerjem in ciljno predlogo ni znana, kot je prstni odtis AFLP DNA.
Sorodni kompleti PCR
2× PCR junakTMSistem Mix ima višjo toleranco na zaviralce PCR kot običajni sistem PCR Mix in se zlahka spopade s PCR pomnoževanjem različnih kompleksnih predlog.Zaradi edinstvenega reakcijskega sistema in visokoučinkovitega Taq Hero ima reakcija PCR večjo učinkovitost pomnoževanja, specifičnost in občutljivost.
Večja učinkovitost ojačanja
Ima 5'→3' DNA polimerazno aktivnost in 5'→3' eksonukleazno aktivnost, brez 3'→5' eksonukleazne aktivnosti.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specifičen—optimiziran pufer in encim Taq za vroč zagon lahko preprečita nespecifično pomnoževanje in tvorbo dimerja primerja
Visoka občutljivost—lahko zazna majhne kopije predloge
Komplet uporablja edinstven reagent za reverzno transkripcijo Foregene in DNA polimerazo Foregene HotStar Taq v kombinaciji z edinstvenim reakcijskim sistemom za učinkovito izboljšanje učinkovitosti pomnoževanja in specifičnosti reakcije.
Čas objave: maj-09-2023
