Ni ojačanih signalov

1. Taq DNA polimeraza v kompletu izgubi svojo aktivnost zaradi nepravilnega shranjevanja ali izteka roka uporabnosti kompleta.
Priporočilo: Preverite pogoje shranjevanja kompleta;znova dodajte ustrezno količino Taq DNA polimeraze sistemu PCR ali kupite nov komplet PCR v realnem času za sorodne poskuse.

2. V predlogi DNK je veliko zaviralcev Taq DNA polimeraze.
Predlog: ponovno prečistite predlogo ali zmanjšajte količino uporabljene predloge.

3. Koncentracija Mg2+ ni primerna.
Priporočilo: Koncentracija Mg2+ mešanice 2× Real PCR, ki jo nudimo, je 3,5 mM.Pri nekaterih posebnih primerjih in šablonah pa je lahko koncentracija Mg2+ višja.Zato lahko neposredno dodate MgCl2, da optimizirate koncentracijo Mg2+.Za optimizacijo je priporočljivo povečati Mg2+ za 0,5 mM vsakič.

4. Pogoji pomnoževanja PCR niso primerni, zaporedje ali koncentracija primerja pa je neustrezna.
Predlog: potrdite pravilnost zaporedja primerja in primer ni bil razgrajen;če ojačanje signala ni dobro, poskusite znižati temperaturo žarjenja in ustrezno prilagoditi koncentracijo primerja.

5. Količina predloge je premajhna ali prevelika.
Priporočilo: Izvedite redčenje z linearizacijo predloge z gradientom in izberite koncentracijo predloge z najboljšim učinkom PCR za poskus PCR v realnem času.

NTC ima previsoko vrednost fluorescence

1. Kontaminacija z reagentom med delovanjem.
Priporočilo: Zamenjajte z novimi reagenti za poskuse PCR v realnem času.

2. Med pripravo reakcijskega sistema PCR je prišlo do kontaminacije.
Priporočilo: Med delom izvajajte potrebne zaščitne ukrepe, kot so: nošenje rokavic iz lateksa, uporaba pipete s filtrom itd.

3. Primerji se razgradijo, razgradnja primerjev pa bo povzročila nespecifično pomnoževanje.
Predlog: Uporabite elektroforezo SDS-PAGE, da ugotovite, ali so primerji razgrajeni, in jih zamenjajte z novimi primerji za poskuse PCR v realnem času.

Primerni dimer ali nespecifična amplifikacija

1. Koncentracija Mg2+ ni primerna.
Priporočilo: Koncentracija Mg2+ mešanice 2× Real PCR EasyTM Mix, ki jo nudimo, je 3,5 mM.Pri nekaterih posebnih primerjih in šablonah pa je lahko koncentracija Mg2+ višja.Zato lahko neposredno dodate MgCl2, da optimizirate koncentracijo Mg2+.Za optimizacijo je priporočljivo povečati Mg2+ za 0,5 mM vsakič.

2. Temperatura žarjenja PCR je prenizka.
Predlog: vsakič zvišajte temperaturo žarjenja PCR za 1 ℃ ali 2 ℃.

3. Izdelek PCR je predolg.
Priporočilo: Dolžina produkta PCR v realnem času mora biti med 100-150 bp, ne več kot 500 bp.

4. Primerji se razgradijo in razgradnja primerjev bo povzročila pojav specifičnega ojačanja.
Predlog: Uporabite elektroforezo SDS-PAGE, da ugotovite, ali so primerji razgrajeni, in jih zamenjajte z novimi primerji za poskuse PCR v realnem času.

5. Sistem PCR ni ustrezen ali pa je sistem premajhen.
Predlog: premajhen reakcijski sistem PCR bo povzročil zmanjšanje natančnosti zaznavanja.Najbolje je, da uporabite reakcijski sistem, ki ga priporoča instrument za kvantitativno PCR, da ponovno izvedete poskus PCR v realnem času.

Slaba ponovljivost kvantitativnih vrednosti

1. Instrument ne deluje pravilno.
Predlog: med vsako PCR luknjo instrumenta lahko pride do napak, kar povzroči slabo ponovljivost med upravljanjem temperature ali zaznavanjem.Preverite v skladu z navodili ustreznega instrumenta.

2. Čistost vzorca ni dobra.
Priporočilo: Nečisti vzorci bodo povzročili slabo ponovljivost poskusa, kar vključuje čistost predloge in primerjev.Najbolje je ponovno prečistiti šablono, primerje pa najbolje očistiti s SDS-PAGE.

3. Čas priprave in shranjevanja sistema PCR je predolg.
Predlog: Uporabite sistem PCR v realnem času za poskus PCR takoj po pripravi in ​​ga ne puščajte predolgo.

4. Pogoji pomnoževanja PCR niso primerni, zaporedje ali koncentracija primerja pa je neustrezna.
Predlog: potrdite pravilnost zaporedja primerja in primer ni bil razgrajen;če ojačanje signala ni dobro, poskusite znižati temperaturo žarjenja in ustrezno prilagoditi koncentracijo primerja.

5. Sistem PCR ni ustrezen ali pa je sistem premajhen.
Predlog: premajhen reakcijski sistem PCR bo povzročil zmanjšanje natančnosti zaznavanja.Najbolje je, da uporabite reakcijski sistem, ki ga priporoča instrument za kvantitativno PCR, da ponovno izvedete poskus PCR v realnem času.