RNaza je občutljiva beseda, ki je mnogi študenti, ki pogosto izvajajo poskuse ekstrakcije RNK, ne želijo slišati.Popolnoma oborožena je bila RNA, ki je bila končno ekstrahirana z zelo strupenima reagentoma fenolom in kloroformom, razgrajena.Nisem se sprijaznil!!!Danes si poglejmo izvor slavne Rnase.

Ribonukleaza (RNase) ali RNaza je nukleaza, ki lahko hidrolizira RNK v majhne molekule.RNaza je kot beljakovina z majhno molekulo nenavadno stabilna .Običajna sterilizacija s paro pri visoki temperaturi in visokem tlaku ter proteinski inhibitorji ga ne morejo popolnoma onesposobiti.Stabilnost RNaze v glavnem izhaja iz disulfidnih vezi v strukturi.Na primer, običajno uporabljena RNaza goveje trebušne slinavke ima samo 124 aminokislin, vendar vsebuje 4 disulfidne vezi.Žveplova vez in disulfidna vez dajeta RNazi odlično toplotno stabilnost.Poleg tega ima rnaza relativno majhno molekulsko maso in lahko v mnogih primerih hitro obnovi svojo prvotno konformacijo.

Poleg tega, da je izjemno stabilen,RNaze so vseprisotne v laboratoriju .RNaza je biološki obrambni mehanizem.Za celico je eksogena RNA pogosto usodna.V primerjavi z eksogeno DNA je eksogena RNA pogosto bolj nevarna.RNA se srečno prepisuje in prevaja, zato so skoraj vsi organizmi razvili RNaze za obrambo pred vdorom eksogene RNA.Zato bakterijske celice, gojene v laboratoriju, in vi, ki ekstrahirate RNK, izžarevajo aromo RNaze.Človeške telesne tekočine (slina, solze itd.) vsebujejo veliko količino RNaze, zato ne jokajte, ko se RNK razgradi.Bolj kot jokaš, hujša je razgradnja RNK!!Sestra Daiyu ni primerna za ekstrakcijo RNK!

Poleg tega vaša nežna koža vsebuje tudi veliko RNaze, markerji, pipete, vrata hladilnika in ročaji vrat, ki se jih je dotaknila koža, prav tako vsebujejo RNazo.

S toliko blodnjanjem si poglejmo, kako ravnati z RNazami.

Prva stvar, na katero vsi pomislijo ob odstranitvi RNA, jeDEPC(dietil pirokarbonat).DEPC v glavnem denaturira protein tako, da se združi z imidazolnim obročem histidina aktivne skupine RNaze in tako zavira aktivnost encima.0,1% DEPC ima lahko boljši učinek odstranjevanja Rnase, vendar moramo biti pozorni, da je DEPC znan rakotvorni dejavnik, zato je pri njegovi uporabi potrebna posebna pozornost.

Za RNazo moramo izhajati iz dveh vidikov,prvi je zaviranje aktivnosti endogene RNaze

Običajni reagenti za ekstrakcijo RNK, kot sta gvanidin izotiocianat in DTT, ki jih vsebuje Trizol, lahko odprejo disulfidno vez RNaze, vendar je še vedno nekaj RNaz, zlasti v vzorcih tkiv, zato bodite pozorni na nizko temperaturo.

1.Ko vzorec tkiva vzamete ven, ga takoj potopite v tekoči dušik ali v komercialno raztopino za konzerviranje RNA.

2.Po ekstrakciji RNA celičnega vzorca jo dodajte raztopini za lizo in jo lizirajte na posodi za led

3. Za mletje je najbolje uporabiti tekoči dušik ko so vzorci tkiva homogenizirani.Pri uporabi električnega homogenizatorja brez tekočega dušika bodite pozorni na popolnoma predhodno ohlajanje adapterja za homogenat.

Druga je eksogena DNaza

1.Bodite popolnoma oboroženi, nosite laboratorijski plašč, nosite masko in obvezno nosite par novih rokavic (ne bodite tako varčni!! Upoštevati je treba, da je Trizol zelo jedek in je tudi zelo močan skozi rokavice, zato ne kapljajte na roke).

2.Vse uporabljene konice pipet, epruvete EP, epruvete PCR in drugo opremo je treba obdelati z de-RNazo.Lahko se namoči v 0,1 % DEPC in nato pod visokim pritiskom.Bodite pozorni na delovanje v dimni napi.Lokalni tirani lahko neposredno kupijo potrošni material za odstranjevanje encimov.

PS: Naj vam povem leno metodo.Čeprav visoka temperatura in visok pritisk ne moreta popolnoma odstraniti RNaze, bosta odstranila velik del le-te.2-kratna visoka temperatura in visok tlak ima dober učinek, ekstrakcija RNK pa ima majhen učinek.

3.Alkohol lahko denaturira beljakovine,zato lahko mizo za ekstrakcijo RNK obrišemo s 75% alkoholom , z alkoholom pa lahko poškropite tudi rokavice.

4.Končno raztopino za raztapljanje RNK in centrifugalno epruveto je treba prav tako obdelati z de-RNAzo.DEPC voda je pogosto uporabljena raztopina za raztapljanje RNA.Pogovorimo se o pravilni metodi priprave DEPC vode (ne pozabite prepakirati komercialne DEPC, ko jo kupite)

Dodajte DEPC ultra čisti vodi pri 1:1000, dobro pretresite, pustite stati čez noč pri 37 °C in sterilizirajte pri 121 °C pri visoki temperaturi in visokem tlaku 15 minut.DEPC vodo lahko shranjujete pri -20 °C v 1 ml alikvotih.

Nazadnje, če povzamem: nizka temperatura je ključna, s potrošnim materialom se dobro ravna, popolnoma oborožen in manj govorjenja!

No, to je to za današnjo strategijo.Želim vam vso koncentracijo in čistost RNK, ki ste jo omenili.Oba A260/A280 sta 2.0!!!

Seveda, če uporabljate adelovanje pri sobni temperaturi Komplet za ekstrakcijo RNK, morda ne boste naleteli na zgornje težave.

Delovanje pri sobni temperaturi, brez dodajanja DNaze, ekstrahira celotno RNK iz celic v 11 minutah in ekstrahira celotno RNK iz živalskih tkiv ali rastlin v 30 minutah.

Za poskusne vzorce se obrnite na:overseas@foregene.com

Podobni izdelki:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/