Pri poskusih qPCR je zelo pomembna povezava tudi oblikovanje primerja.Ali so primerji primerni ali ne, je tesno povezano s tem, ali učinkovitost pomnoževanja doseže standard, ali so pomnoženi produkti specifični in ali so na voljo eksperimentalni rezultati.
Kako torej izboljšati specifičnost primerja qPCR?Visoka učinkovitost ojačanja?
Danes vas bomo popeljali k oblikovanju primerjev qPCR skupaj in naj bo načrtovanje primerjev qPCR postalo učinkovita znanstvena veščina pri poskusih.
Pri načrtovanju primerjev qPCR bodite običajno pozorni na naslednje točke: primerji morajo biti zasnovani čim bolj čez introne, dolžina izdelka mora biti 100–300 bp, vrednost Tm mora biti čim bližje 60 °C, zgornji in spodnji primerji pa morajo biti čim bližje, konec primerja pa mora biti G ali C itd. počakajte.
1. Oblikovanje primerjev, ki zajemajo introne
Pri načrtovanju primerjev qPCR lahko izbira primerjev, oblikovanih čez introne, prepreči pomnoževanje predloge gDNA, vsi produkti pa izhajajo iz pomnoževanja cDNA, s čimer se odpravi vpliv kontaminacije gDNA.
2. Dolžina primerja
Dolžina primerja je na splošno med 18-30 nt, dolžino produkta pomnoževanja pa je treba čim bolj nadzorovati med 100-300 bp.
Če je primer prekratek, bo povzročil nespecifično pomnoževanje, če pa je predolg, bo zlahka oblikoval sekundarno strukturo (kot je lasna struktura).Če je produkt pomnoževanja predolg, ni primeren za reakcijo polimeraze, kar bo vplivalo na učinkovitost pomnoževanja PCR.
3. Vsebnost GC in vrednost Tm
Vsebnost GC v temeljnih premazih je treba nadzorovati med 40 % in 60 %.Če je previsok ali prenizek, ni primeren za sprožitev reakcije.Vsebnost GC v prednjem in povratnem temeljnem premazu mora biti približno enaka, da dobimo enako vrednost Tm in temperaturo žarjenja.
Vrednost Tm mora biti čim bolj med 55–65 °C, na splošno okoli 60 °C, vrednost Tm navzgor in navzdol pa mora biti čim bližje, po možnosti ne več kot 4 °C.
4. Izogibajte se izbiri A na 3' koncu temeljnega premaza
Ko se 3′ konec primerja ne ujema, obstajajo velike razlike v učinkovitosti sinteze različnih baz.Ko je zadnja baza A, lahko prav tako sproži verižno sintezo tudi v primeru neusklajenosti, in ko je zadnja baza T Ko je učinkovitost indukcije neusklajenosti močno zmanjšana.Zato se poskusite izogniti izbiri A na 3' koncu temeljnega premaza in bolje je izbrati T.
Če gre za temeljni premaz sonde, 5'-konec sonde ne more biti G, kajti tudi ko je ena sama baza G povezana s skupino fluorescenčnega reporterja FAM, lahko G prav tako duši fluorescentni signal, ki ga oddaja skupina FAM, kar ima za posledico lažno negativne rezultate.Pojavi se.
5. Osnovna porazdelitev
Porazdelitev štirih baz v primerju je po možnosti naključna, izogibanje več kot 3 zaporednim G ali C na koncu 3' in več kot 3 zaporednimG ali C je enostavno ustvariti parjenje v regiji sekvence, bogati z GC.
6. Območje oblikovanja temeljnega premaza se mora izogibati kompleksnim sekundarnim strukturam.
Sekundarna struktura, ki jo tvori posamezna veriga produkta pomnoževanja, bo vplivala na nemoten potek PCR.Z vnaprejšnjim napovedovanjem, ali obstaja sekundarna struktura v ciljnem zaporedju, se poskusite izogniti tej regiji pri načrtovanju primerjev.
7. Sami začetniki in med začetnimi začetnicami se morajo izogibati zaporednim komplementarnim bazam.
Med samim primerjem in primerjem ne more biti zaporedne komplementarnosti 4 baz.Sam temeljni premaz ne sme imeti komplementarnega zaporedja, sicer se bo prepognil in oblikoval lasno strukturo, kar bo vplivalo na kombinacijo žarjenja primerja in šablone.
Komplementarna zaporedja ne morejo obstajati med gorvodnimi in spodnjimi primerji.Komplementarnost med primerji bo povzročila dimerje primerjev, kar bo zmanjšalo učinkovitost PCR in celo vplivalo na kvantitativno natančnost.Če sta strukturi primer-dimer in lasnica neizogibni, vrednost △G ne sme biti previsoka (naj bo manjša od 4,5 kcal/mol).
8. Primerji pomnožijo ciljno specifični produkt.
Končni cilj odkrivanja qPCR je razumeti številčnost ciljnega gena.Če pride do nespecifičnega pomnoževanja, bo kvantifikacija netočna.Zato jih je treba po oblikovanju primerjev testirati z BLAST, specifičnost izdelkov pa primerjati v zbirki podatkov o zaporedjih.
Nato vzamemo človeški gen GAS6 (specifičen za zaustavitev rasti 6) kot primer za oblikovanje primerjev qPCR.
01 poizvedba gen
Homo GAS6preko NCBI.Tukaj bi morali biti pozorni na primerjavo imena gena in vrste, da zagotovimo njihovo skladnost.
02 Poiščite zaporedje genov
(1) Če je ciljno zaporedje genomska DNA, izberite prvo, ki je zaporedje genomske DNA gena.
(2) Če je ciljno zaporedje mRNA, izberite drugo.Po vnosu v spodnji tabeli kliknite »CDS«.Zaporedje rjavega ozadja je kodirno zaporedje gena.
03 Primeri za oblikovanje
Vstopite v vmesnik Primer-BLAST
Zgoraj levo vnesite zaporedno številko gena ali zaporedje v formatu Fasta in izpolnite ustrezne parametre.

Kliknite »Get primers« in NCBI se bo pojavil, da vam bo povedal, da bo taka izbira parametrov razširjena na druge različice spajanja.Lahko preverimo različne variante spajanja in jih predložimo, da dobimo ustrezen par primerjev (kot je prikazano na spodnji sliki).Ta postopek lahko traja več deset sekund.
Temperature žarjenja teh parov primerjev so okoli 60 °C.Glede na namen poskusa izberite primerje z zmerno dolžino, dobro specifičnostjo in manj samodopolnjevanja primerjev za poskus, stopnja uspešnosti pa je precej visoka!
04 Preverjanje specifičnosti primerja
Pravzaprav lahko Primer-Blast poleg oblikovanja temeljnih premazov tudi oceni temeljne premaze, ki smo jih oblikovali sami.Vrnite se na stran z zasnovo primerkov, vnesite zgornje in spodnje primerke, ki smo jih oblikovali, in drugi parametri ne bodo prilagojeni.Po oddaji lahko vidite, ali par primerjev obstaja tudi na drugih genih.Če so vsi prikazani na genu, ki ga želimo pomnožiti, to pomeni, da je specifičnost tega para primerjev odlična!(To je na primer edini rezultat poizvedbe primer!)

05 Presoja kakovosti temeljnega premaza
Kakšna vrsta primerja je "popoln" temeljni premaz, ki združuje "učinkovitost ojačanja do standarda", "ojačane lastnosti izdelka" in "zanesljive eksperimentalne rezultate"?
Učinkovitost ojačanja

krivulja taljenja
Učinkovitost pomnoževanja primerjev doseže 90%-110%, kar pomeni, da je učinkovitost pomnoževanja dobra, krivulja taljenja pa ima en vrh in običajno Tm>80 °C, kar pomeni, da je specifičnost pomnoževanja dobra.
 
Podobni izdelki:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
PCR v realnem času Easy-Taqman