PCR v realnem času, znan tudi kot kvantitativni PCR ali qPCR, je metoda za spremljanje in analizo produktov pomnoževanja PCR v realnem času.
Ker ima kvantitativna PCR prednosti preprostega delovanja, hitrega in priročnega, visoke občutljivosti, dobre ponovljivosti in nizke stopnje kontaminacije, se pogosto uporablja pri medicinskem testiranju, oceni učinkovitosti zdravil, raziskavah izražanja genov, transgenih raziskavah, odkrivanju genov, odkrivanju patogenov, odkrivanju živali in rastlin., testiranje hrane in druga področja.
Ne glede na to, ali se ukvarjate s temeljnimi raziskavami na področju znanosti o življenju, ali ste zaposleni v farmacevtskih podjetjih, živinorejskih podjetjih, živilskih podjetjih ali celo zaposleni v inšpekcijskih in karantenskih uradih, oddelkih za spremljanje okolja, bolnišnicah in drugih enotah, boste bolj ali manj izpostavljeni ali pa morate poznati znanje o obvladovanju kvantitativnega PCR.

Načelo PCR v realnem času

Real Time PCR je metoda, pri kateri se v PCR reakcijski sistem dodajo fluorescenčne snovi, intenzivnost fluorescenčnega signala v procesu PCR reakcije pa se v realnem času spremlja s kvantitativnim PCR instrumentom, na koncu pa se eksperimentalni podatki analizirajo in obdelajo.

【Krivulja ojačanja】je krivulja, ki opisuje dinamični proces PCR.Krivulja pomnoževanja PCR pravzaprav ni standardna eksponentna krivulja, temveč sigmoidna krivulja.

[Platformska faza ojačitvene krivulje]S povečanjem števila ciklov PCR, inaktivacijo DNA polimeraze, izčrpanostjo dNTP in primerjev ter inhibicijo reakcije sinteze s stranskim produktom reakcije pirofosfatom itd., se PCR ne širi vedno eksponentno., in bo sčasoma prešel na planoto.

[Območje eksponentne rasti krivulje ojačanja]Čeprav se faza platoja močno spreminja, je v določenem območju območja eksponentne rasti pomnoževalne krivulje ponovljivost zelo dobra, kar je zelo pomembno za kvantitativno analizo PCR.

[Vrednost praga in vrednost Ct]Mejno vrednost detekcije fluorescence nastavimo na ustrezno mesto v območju eksponentne rasti krivulje pomnoževanja, in sicer mejno vrednost (Threshold).Presečišče vrednosti praga in krivulje ojačanja je vrednost Ct, kar pomeni, da se vrednost Ct nanaša na število ciklov (cikel praga), ko je dosežena vrednost praga.

Spodnji graf jasno prikazuje razmerje med črto praga in krivuljo ojačanja, pragom in vrednostjo Ct.

【Kako kvantificirati?】

Z matematično teorijo je bilo dokazano, da ima vrednost Ct inverzno linearno razmerje z logaritmom števila začetnih predlog.PCR v realnem času spremlja produkte pomnoževanja PCR v realnem času in jih kvantificira med fazo eksponentnega pomnoževanja.

Za vsak cikel PCR se je DNK eksponentno povečala za 2-krat in kmalu dosegla plato.

Ob predpostavki, da je količina začetne DNK A₀ , po n ciklih lahko teoretično količino produkta DNA izrazimo kot:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Nato, večja kot je začetna količina DNK A 0, prej količina pomnoženega produkta doseže detekcijsko vrednost An in število ciklov pri doseganju An je vrednost Ct.To pomeni, da večja kot je začetna količina DNK A 0, prej doseže vrh krivulje pomnoževanja in ustrezno manjše je potrebno število ciklov n.

Izvedemo gradientno redčenje standarda z znano koncentracijo in ga uporabimo kot predlogo za PCR v realnem času, pri čemer bomo v enakih intervalih dobili niz pomnoževalnih krivulj v vrstnem redu začetne količine DNK od večje do manjše.Glede na linearno razmerje med vrednostjo Ct in logaritmom števila začetnih predlog, a[standardna krivulja] je mogoče ustvariti.

Če vrednost Ct vzorca z neznano koncentracijo nadomestimo s standardno krivuljo, lahko dobimo začetno količino vzorca z neznano koncentracijo, kar je kvantitativno načelo PCR v realnem času.

Metoda odkrivanja PCR v realnem času

PCR v realnem času zazna produkte pomnoževanja PCR z zaznavanjem intenzivnosti fluorescence v reakcijskem sistemu.

Načelo metode vgradnje fluorescentnega barvila】

Fluorescentna barvila, kot je TB Green ® , se lahko nespecifično vežejo na dvoverižno DNA v PCR sistemih in ob vezavi fluorescirajo.

Intenzivnost fluorescence v reakcijskem sistemu se je eksponentno povečevala s povečanjem ciklov PCR.Z zaznavanjem intenzivnosti fluorescence je mogoče v realnem času spremljati količino pomnoževanja DNA v reakcijskem sistemu, nato pa je mogoče obratno oceniti količino začetne predloge v vzorcu.

【Princip metode fluorescenčne sonde】

fluorescentna sondaje zaporedje nukleinske kisline s fluorescenčno skupino na 5' koncu in skupino za dušenje na 3' koncu, ki se lahko specifično veže na predlogo.Ko je sonda nedotaknjena, fluorescenco, ki jo oddaja fluorofor, ugasne dušilna skupina in ne more fluorescirati.Ko se sonda razgradi, bo fluorescentna snov disociirala in oddala fluorescenco.

Reakcijski raztopini PCR dodamo fluorescenčno sondo.Med postopkom žarjenja se fluorescentna sonda veže na določen položaj šablone.Med postopkom podaljšanja lahko eksonukleazna aktivnost 5'→3' encima PCR razgradi fluorescenčno sondo, hibridizirano s šablono, in fluorescentna snov se disociira, da oddaja fluorescenco.Z detekcijo intenzivnosti fluorescence sonde v reakcijskem sistemu je mogoče doseči namen spremljanja količine pomnoževanja produkta PCR.

【Izbira metode detekcije fluorescence】

Če se uporablja za razlikovanje zaporedij z visoko homologijo in izvajanje multipleksne detekcije PCR, kot je analiza tipizacije SNP, je metoda fluorescentne sonde nenadomestljiva.
Za druge poskuse PCR v realnem času je mogoče uporabiti preprosto, enostavno in poceni metodo fluorescentne himere.

sonde Močna specifičnost, zmožna multipleksne PCR

Pomanjkljivost

Visoke specifične zahteve za pomnoževanje;

multipleksne PCR ni mogoče izvesti. Potreba po oblikovanju posebnih sond, visoki stroški;

včasih je načrtovanje sonde težko

Podobni izdelki: