RT-qPCR je osnovni eksperiment molekularne biologije in vsi ga morajo poznati.V glavnem vključuje tri korake: ekstrakcijo RNA, reverzno transkripcijo v cDNA in fluorescentno kvantitativno PCR v realnem času.Ne pomaga, kaj se dogaja?Verjetno obstaja težava zposkus obratne transkripcije!Čeprav se zdi, da mora poskus reverzne transkripcije dodati samo RNA, dNTP, primerje inreverzna transkriptazav epruveto centrifuge in dobro premešajte, vendar je v dejanskem procesu delovanja še veliko podrobnosti, na katere je treba biti pozoren.Naučimo se o tem!

Kako oceniti kakovost RNA?
Za pridobitev cDNA je kakovost RNA kritična!Kakovost RNA je mogoče zaznati predvsem z dveh vidikov:
(1) Celovitost RNA:Celovitost RNA je mogoče preveriti z elektroforezo v agaroznem gelu. Če za primer vzamemo evkarionte, ima celotna skupna RNA tri jasne pasove, molekulske mase od velike do majhne so 28S, 18S in 5S, 28S pa je dvakrat svetlejša od 18S;če so vidni trije pasovi, vendar je vrsta traku zamegljena ali Difuzija pomeni, da je RNA delno razgrajena.Prosimo, takoj izvedite reakcijo povratne transkripcije in ustrezno povečajte vnos predloge;če je mogoče videti le trak z majhno molekulsko maso ali nobenega pasu, je bila RNA popolnoma razgrajena in jo je treba ponovno ekstrahirati.Agilent 2100 označuje celovitost RNA z diagramom vrhov in vrednostjo RIN.Če je nukleinska kislina nedotaknjena, je osnovna linija elektroferograma ravna;če je nukleinska kislina močno razgrajena, je izhodiščna linija neenakomerna in pojavi se več vrhov razgradnje;vrednost RIN odraža celovitost RNA v razponu 0-10, večja kot je vrednost, boljša je kakovost RNA.No, višja je stopnja popolnosti.
(2) Čistost RNA:Razmerje OD260/280 je mogoče zaznati z UV spektrofotometrijo.Če je razmerje OD260/280 med 1,9 in 2,1, je čistost zelo dobra.
Preostala genomska DNK lahko povzroči netočne kvantitativne rezultate
Ko ekstrahiramo RNA, je lahko RNA, ki jo dobimo, pomešana z genomsko DNA (gDNA), ki ni bila očiščena.Zato bo tudi cDNA po reverzni transkripciji pomešana zgDNA.Med dolvodnim tokomqPCRreakcija,cDNAin gDNA se lahko pomnožita hkrati, kar ima za posledico relativno majhno vrednost CT, zato so lahko rezultati pristranski.
Kaj naj torej storimo v tej situaciji?Foregenepredlaga:
(1) Izvedite čiščenje genoma na obrnjeni RNA, ki jo lahko odstranite z ekstrakcijo kolone med ekstrakcijo RNA;
(2) Ekstrahirano RNA obdelajte z DNazoI , vendar ga zaključite z EDTA;
reagentov za reverzno transkripcijoz moduli za čiščenje genoma;

Kako izbrati primerje za reverzno transkripcijo?
Primerji reverzne transkripcije prav tako vplivajo na izid reakcije reverzne transkripcije.Izberete lahko naključne primerje, Oligo dT ali gensko specifične primerje za reverzno transkripcijo glede na specifične okoliščine poskusa:
(1) Posebni prepisi: priporočeni so gensko specifični primerji;
(2) Dolgi prepisi fragmentov: Oligo dT/gensko specifični primerji so priporočeni;
(3) Notranji fragmenti transkriptov dolgih segmentov: gensko specifični primerji/naključni primerji/naključni primerji + Oligo dT.Če se izvede naslednji poskus qPCR, Oligo dT ni mogoče uporabiti samostojno, ker lahko uporaba samega Oligo dT povzroči pristranskost 3' konca, kar povzroči netočne rezultate poskusa qPCR;
(4) miRNA: Uporabite lahko temeljne premaze stebelne zanke ali temeljne premaze repa.

Kolikokrat je treba produkt reverzne transkripcije cDNA razredčiti za kvantifikacijo?
Po pridobitvi cDNA produkta reverzne transkripcije je zelo pomembno, kolikokrat je treba cDNA razredčiti za poskuse qPCR.Če je koncentracija cDNA previsoka ali prenizka, lahko to vpliva na učinkovitost pomnoževanja.Ali je mogoče izmeriti koncentracijo cDNA in kako?
(1) Koncentracije cDNA produkta reverzne transkripcije ni mogoče izmeriti, ker produkt reverzne transkripcije poleg produkta cDNA vsebuje tudi pufer za ostanke reverzne transkripcije, reverzno transkriptazo, primerje itd., kar bo vplivalo na rezultate meritev koncentracije in povzročilo nenormalno razmerje OD260/280, OD260/230 in zato ne odraža pravega izkoristka cDNA.V tem času bodo nekateri prijatelji rekli, takrat bom izmeril koncentracijo po čiščenju;tukaj bi Foregene rad spomnil, da cDNA ni priporočljivo čistiti, ker je dolžina cDNA, pridobljena z obračanjem, drugačna, kratka cDNA pa se bo pri čiščenju izgubila.
(2) Kaj torej storiti?Pred poskusom qPCR je mogoče s predposkusom določiti gradient redčenja cDNA.Na primer: uporabite osnovno raztopino cDNA, 10-kratno razredčitev in 100-kratno razredčitev kot predloge za poskuse qPCR in izberite faktor redčenja z vrednostjo CT v območju 18–28.

Kako naj se miRNA reverzno prepišejo?
miRNA je enoverižna majhna molekula RNA z velikostjo približno 22 nt, ki ne kodira beljakovin.Zaradi kratke dolžine jo je s konvencionalno metodo qPCR težko neposredno kvantificirati, zato je pogosto treba razširiti miRNA;pogosto uporabljene metode reverzne transkripcije za miRNA vključujejo metodo stem-loop in metodo repa.
Metoda matične zanke je razširitev miRNA z dodajanjem primerjev matične zanke.Ta metoda zaznavanja ima večjo občutljivost in specifičnost, vendar je prepustnost zaznavanja nizka.Ena povratna transkripcija lahko zazna samo eno miRNA in notranjo referenco;metoda dodajanja repa je sestavljena iz dveh. Dokonča jo skupno delovanje dveh encimov, ki sta polimeraza PolyA in reverzna transkriptaza.Polimeraza PolyA je odgovorna za dodajanje repov PolyA miRNA, da se poveča njena dolžina, reverzna transkriptaza pa izvede reakcijo povratne transkripcije.Ta metoda ima visoko prepustnost zaznavanja in lahko zazna več miRNA in notranjih referenc v eni povratni transkripciji, vendar sta občutljivost in specifičnost nizki pri metodi matične zanke.