Specifičnost detekcije
V večini primerov je namen zasnove primerja povečati specifičnost PCR.To je odvisno od bolj ali manj predvidljivega vpliva številnih spremenljivk.Ena od pomembnih spremenljivk je zaporedje na 3'koncu primerja.
Pomembno je, da je bolj verjetno, da bodo testi PCR, zasnovani za specifičnost, ohranili visoko učinkovitost v širokem dinamičnem razponu, ker test ne proizvaja nespecifičnih produktov pomnoževanja, s čimer tekmuje z reagenti PCR ali zavira glavno reakcijo pomnoževanja.
Seveda v nekaterih primerih specifičnost ni najpomembnejša, na primer, ko je cilj kvantificirati tesno povezane, vendar različne patogene, so potrebni posebni standardi načrtovanja, optimizacije in preverjanja.
Talilna krivulja je standardna metoda za ocenjevanje specifičnosti amplikonov, vsaj v smislu, ali je treba pomnožiti posamezno tarčo.Vendar je treba poudariti, da so krivulje taljenja lahko zavajajoče, ker lahko nanje na primer vplivajo kombinirani učinki neoptimalnih primerjev in nizkih koncentracij šablon.
P5 |Krivulja taljenja prikazuje premike Tm, dobljene z dvema detekcijama različnih količin dveh ciljnih DNK.
A. Pri višjih koncentracijah (ad)) po končani meritvi qPCR ni očitnega dimera primerja.Ko se koncentracija predloge zmanjša na 50 kopij (e), se začne pojavljati nespecifični izdelek in postane edini izdelek z najnižjo koncentracijo (f).
B. Test je zabeležil isti Tms pri vseh ciljnih koncentracijah in ni bilo očitnega dimera primerja niti pri najnižji koncentraciji (5 kopij).Pri uporabi teh dveh detekcijskih metod v NTC niso bili zaznani produkti pomnoževanja.
P5 prikazuje krivulje raztapljanja, dobljene z vzorci, v katerih je predloga prisotna v različnih koncentracijah.P 5a kaže, da je pri dveh najnižjih koncentracijah Tms proizvedenih nespecifičnih produktov pomnoževanja nižji od Tms specifičnih amplikonov.
Očitno te metode odkrivanja ni mogoče zanesljivo uporabiti za odkrivanje tarč, ki obstajajo v nizkih koncentracijah.
Zanimivo je, da NTC, tj. vzorci brez DNK, niso zabeležili (nespecifičnih) produktov pomnoževanja, kar kaže, da lahko genomska DNK v ozadju sodeluje pri nespecifičnem pomnoževanju/polimerizaciji.
Včasih takšnih primerjev v ozadju in nespecifičnega pomnoževanja ni mogoče popraviti, vendar je pogosto mogoče oblikovati metodo odkrivanja, ki nima nespecifičnega pomnoževanja v nobeni koncentraciji predloge in NTC (P 5b).
Tukaj bo celo beleženje ojačanja ciljne koncentracije s Cq 35 povzročilo specifično krivuljo raztapljanja.Podobno NTC-ji niso pokazali znakov nespecifičnega ojačanja.Včasih je lahko zaznavno vedenje odvisno od matične lužnice in v določenih sestavkih pufra je zaznano le nespecifično pomnoževanje, ki je lahko povezano z različnimi koncentracijami Mg2+.
Stabilnost detekcije
Optimizacija Ta je koristen korak v empiričnem preverjanju in procesu optimizacije detekcije qPCR.Zagotavlja neposredno navedbo robustnosti kompleta temeljnih premazov s prikazom temperature (ali temperaturnega območja), ki povzroči najnižji Cq brez ojačanja NTC.
Dvo- do štirikratna razlika v občutljivosti morda ni pomembna za ljudi z visoko izraženostjo mRNA, pri diagnostičnih testih pa lahko pomeni razliko med pozitivnimi in lažno negativnimi rezultati.
Lastnosti Ta primerjev qPCR se lahko zelo razlikujejo.Nekateri testi niso zelo robustni in če se ne izvajajo pod optimalno vrednostjo Ta primerjev, se bodo hitro zrušili.
To je pomembno, ker je ta vrsta odkrivanja v resničnem svetu pogosto problematična in čistost vzorca, koncentracija DNK ali prisotnost druge DNK morda niso optimalni.
Poleg tega se lahko ciljno število kopij razlikuje v širokem razponu, reagenti, plastični pripomočki ali instrumenti pa se lahko razlikujejo od tistih, ki so bili uporabljeni pri nastavitvi testa.
P6|Temperaturni gradient kaže različno robustnost detekcije PCR.
A. Uporabite Bioline Sensifast SYBR mastermix (kataloška številka BIO-98050) za izvedbo PCR na cDNA, pripravljenem iz RNA človeških možganov.
B. Uporabite Bio-Radov instrument CFX qPCR za snemanje zemljevida pomnoževanja in krivulje raztapljanja apalena (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Graf ojačanja in krivulja taljenja ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Graf pomnoževanja in krivulja raztapljanja GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs, zabeležen pri različnih temperaturah žarjenja, ki prikazuje razliko v Cq, zabeleženem pod temperaturnim gradientom 7 C.
P 6 prikazuje tipičen rezultat nezaželenega testa, kjer je bil qPCR izveden z uporabo gradienta Tas med 59C in 67C (P 6a), z uporabo primerjev za tri gene, specifične za človeške možgane.
Iz grafa pomnoževanja je razvidno, da primerji Opalin še zdaleč niso idealni, ker je njihovo optimalno območje Ta zelo ozko (slika 6b), kar pomeni, da so Cq močno razpršeni, zaradi česar so Cq znatno v primerjavi z njihovim optimalnim Cqs Low.
Ta metoda zaznavanja je nestabilna in lahko povzroči neoptimalno ojačanje.Zato bi bilo treba ta par primerkov preoblikovati.Poleg tega analiza talilne krivulje (vložek) kaže, da je specifičnost te detekcijske metode lahko tudi problematična, ker je talilna krivulja vsakega Ta drugačna.
Metoda odkrivanja ACSBG1, prikazana v P 6c, je robustnejša od zgornje metode odkrivanja Opalin, vendar je še daleč od idealne in je verjetno, da jo je mogoče izboljšati.
Vendar poudarjamo, da ni nujne povezave med robustnostjo in specifičnostjo, ker krivulja raztapljanja, ki jo ustvari ta metoda odkrivanja, kaže enako najvišjo vrednost v vseh Tas (vložek).
Po drugi strani pa je test robustnosti veliko bolj toleranten, saj proizvaja podobne Cq v širokem razponu Tas, kot v testu GFAP, prikazanem v P 6d.
Razlika v Cqs, pridobljenih v istem območju 8 stopinj Celzija, je manjša od 1, krivulja raztapljanja (vložek) pa potrjuje značilnosti zaznavanja v tem temperaturnem območju.Omeniti velja, da se lahko izračunani Tas in dejanski razpon Ta zelo razlikujeta.
Obstaja veliko smernic, namenjenih raziskovalcem v pomoč pri oblikovanju učinkovitih primerjev, ki večinoma temeljijo na že dolgo uveljavljenih pravilih, veliko pozornosti pa je bilo namenjene 3′-koncu primerjev.Pogosto je priporočljivo vključiti G ali C na 3' koncu in dve bazi G ali C (objemka GC), vendar ne več kot dve od zadnjih 5 baz.
V praksi lahko ta pravila vodijo raziskovalce, vendar niso nujno pravilna v vseh okoliščinah.
P7 |3′-konec primerja ima majhen učinek na specifičnost ali učinkovitost.
A. Položaj primerjev za človeški gen HIF-1α (NM_181054.2).
B. Uporabite matično lužnico Agilent Brilliant III SYBR Green (kat. št. 600882), da pomnožite šest testnih postavk.
C. Graf pomnoževanja in talilna krivulja, posneta z Bio-Radovim instrumentom CFX qPCR in 3'end primerji.NTC so prikazani rdeče.
D. Zapis Cqs vsake testne postavke
Na primer, rezultat v P 7 je v nasprotju s pravilom 3'end.Vsi modeli dajejo v bistvu enake rezultate, le dve kombinaciji primerjev vodita do nespecifičnega pomnoževanja v NTC.
Vendar ne moremo podpreti učinka posnetka GC, ker v tem primeru uporaba A ali T kot največ 30 baz ne zmanjša specifičnosti.
Preizkus C, kjer se F primer konča z GGCC, je zabeležil Cq v NTC, kar kaže, da bi se morda želeli izogniti tem zaporedjem na koncu 30.Poudarjamo, da je edini način za določitev najboljšega 3′-končnega zaporedja para primerjev eksperimentalna ocena nekaterih kandidatov za primerje.
Učinkovitost ojačanja
Pomembno je, da čeprav nespecifična detekcija PCR nikoli ne more postati specifična, je mogoče učinkovitost pomnoževanja prilagoditi in povečati na veliko različnih načinov s spreminjanjem encima, matične lužnice, aditivov in pogojev cikla.
Za ovrednotenje učinkovitosti detekcije PCR je najbolje uporabiti serijsko razredčitev 10- ali 5-kratne ciljne nukleinske kisline, to je »metoda standardne krivulje«.
Če se za ustvarjanje standardne krivulje uporabljajo pomnožki PCR ali sintetične tarče DNA, je treba serijske razredčitve teh tarč zmešati s konstantno količino DNA ozadja (kot je genomska DNA).
P8 |Krivulja redčenja za oceno učinkovitosti PCR.
A. Uporabite primerje za HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA in R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC in Agilentov Brilliant III SYBR Green mastermix (kataloška številka 600882) za PCR in pogoje talilne krivulje.
B. 100 ng RNA smo reverzno prepisali, 2-krat razredčili, serijsko razredčene vzorce cDNA pa 5-krat razredčili na 1 ng človeške genomske DNA.Na vstavku je prikazana talilna krivulja.
C. Reakcijo RT, redčenje in serijsko redčenje smo ponovili za drugi vzorec cDNA in rezultati so bili podobni.
P 8 prikazuje dve standardni krivulji z uporabo iste detekcijske metode na dveh različnih vzorcih cDNA, rezultat je enaka učinkovitost, približno 100 %, podobna pa je tudi vrednost R2, to je stopnja prileganja med eksperimentalnimi podatki in regresijsko črto ali stopnjo linearnosti podatkov.
Obe standardni krivulji sta primerljivi, vendar nista povsem enaki.Če je namen natančno kvantificirati cilj, je treba opozoriti, da je nesprejemljivo zagotoviti izračun števila kopij brez pojasnila negotovosti
P9 |Merilna negotovost, povezana s kvantifikacijo z uporabo standardne krivulje.
A. Za izvedbo PCR in pogojev talilne krivulje uporabite primerje za GAPDH (NM_002046).F: ACAGTTGCCATGTAGACC in R: TAACTGGTTGAGCACAGG in Bioline Sensifast SYBR mastermix (kataloška številka BIO-98050).
B. Diagram pomnoževanja, krivulja taljenja in standardna krivulja, posneta z instrumentom CFX qPCR podjetja Bio-Rad.
C. Graf standardne krivulje in 95 % interval zaupanja (CI).
D. Število kopij in 95-odstotni interval zaupanja treh vrednosti Cq, izpeljanih iz krivulje redčenja.
P 9 kaže, da je pri optimiziranem testu inherentna variabilnost posamezne standardne krivulje približno 2-kratna (95-odstotni interval zaupanja, najmanj do največ), kar je lahko najmanjša variabilnost, ki jo je mogoče pričakovati.
Sorodni izdelek:
Komplet za neposredno PCR živalskega tkiva
Čas objave: 30. september 2021
