RT-qPCR je razvit iz običajne tehnologije PCR.Tradicionalnemu reakcijskemu sistemu PCR doda fluorescentne kemikalije (fluorescentna barvila ali fluorescentne sonde) in zazna postopek žarjenja in podaljšanja PCR v realnem času v skladu z njihovimi različnimi luminiscenčnimi mehanizmi.Spremembe fluorescenčnega signala v mediju se uporabljajo za izračun količine spremembe produkta v vsakem ciklu PCR.Trenutno sta najpogostejši metodi metoda fluorescentnega barvila in metoda sonde.

Metoda fluorescentnega barvanja:
Nekatera fluorescentna barvila, kot so SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO itd., sama po sebi ne oddajajo svetlobe, ampak oddajajo fluorescenco po vezavi na manjši utor dsDNA.Zato naprava na začetku reakcije PCR ne more zaznati fluorescentnega signala.Ko reakcija preide v fazo žarjenja-podaljšanja (metoda v dveh korakih) ali stopnje podaljšanja (metoda v treh korakih), se dvojne verige v tem času odprejo in nova polimeraza DNA Med sintezo verige se fluorescenčne molekule združijo v manjšem utoru dsDNA in oddajajo fluorescenco.Ko se število ciklov PCR povečuje, se vedno več barvil združuje z dsDNA, fluorescenčni signal pa se nenehno krepi.Za primer vzemite SYBR Green Ⅰ.
Metoda sonde:
Taqmanova sonda je najpogosteje uporabljena hidrolizna sonda.Na 5′ koncu sonde je fluorescenčna skupina, običajno FAM.Sama sonda je zaporedje, ki je komplementarno ciljnemu genu.Na 3' koncu fluoroforja je skupina za dušenje fluorescence.V skladu z načelom fluorescenčnega resonančnega prenosa energije (Försterjev resonančni prenos energije, FRET), ko reporterska fluorescentna skupina (donorska fluorescenčna molekula) in dušilna fluorescenčna skupina (akceptorska fluorescenčna molekula) Ko se spekter vzbujanja prekriva in je razdalja zelo blizu (7-10 nm), lahko vzbujanje donorske molekule inducira fluorescenco akceptorske molekule, medtem ko je avtofluorescenca oslabljena.Zato na začetku reakcije PCR, ko je sonda prosta in nedotaknjena v sistemu, reporterska fluorescentna skupina ne bo oddajala fluorescence.Pri žarjenju se temeljni premaz in sonda vežeta na šablono.V fazi podaljšanja polimeraza nenehno sintetizira nove verige.DNA polimeraza ima 5'-3' eksonukleazno aktivnost.Ko doseže sondo, DNA polimeraza hidrolizira sondo iz matrice, loči reportersko fluorescenčno skupino od dušilne fluorescenčne skupine in sprosti fluorescentni signal.Ker obstaja med sondo in šablono razmerje ena proti ena, je metoda sonde boljša od metode barvanja v smislu natančnosti in občutljivosti testa.

Slika 1 Načelo qRT-PCR

Primerno oblikovanje
Načela:

Primerji morajo biti oblikovani v ohranjeni regiji serije nukleinskih kislin in morajo biti specifični.

Najbolje je uporabiti zaporedje cDNA, sprejemljivo je tudi zaporedje mRNA.Če ne, ugotovite zasnovo regije cds zaporedja DNK.
Dolžina fluorescenčnega kvantitativnega produkta je 80–150 bp, najdaljši je 300 bp, dolžina primerja je običajno med 17–25 baz, razlika med zgornjim in spodnjim primerjem pa ne sme biti prevelika.

Vsebnost G+C je med 40% in 60%, najboljša pa je 45-55%.
Vrednost TM je med 58-62 stopinj.
Poskusite se izogniti začetnim dimerjem in samodimerjem, (ne pojavljajte se več kot 4 pari zaporednih komplementarnih baz) lasna struktura, če je neizogibna, naredite ΔG<4,5kJ/mol* Če ne morete zagotoviti, da je bila gDNA odstranjena med reverzno transkripcijo. Čisto, je najbolje, da oblikujete primerje introna *3' konca ni mogoče spremeniti, in da se izognete regijam, bogatim z AT, GC, se izogibajte T/C, A/G neprekinjena struktura (2-3) primerji in ne-
specifična Homologija heterogeno pomnožene sekvence je prednostno manjša od 70 % ali ima homologijo 8 komplementarnih baz.
Baza podatkov:
CottonFGD iskanje po ključnih besedah
Oblikovanje primerja:
Zasnova primerja IDT-qPCR

Slika 2 Stran s spletnim orodjem za oblikovanje temeljnih premazov IDT

Prikaz strani z rezultati na sliki 3
Oblikovanje primerjev lncRNA:
lncRNA:enaki koraki kot mRNA.
miRNA:Načelo metode stem-loop: Ker so vse miRNA kratke sekvence približno 23 nt, neposredne detekcije PCR ni mogoče izvesti, zato se uporablja orodje za zaporedje stem-loop.Zaporedje stebelne zanke je enoverižna DNK s približno 50 nt, ki lahko sama tvori lasno strukturo.3 'Konec je mogoče oblikovati kot zaporedje, ki je komplementarno delnemu fragmentu miRNA, nato se ciljna miRNA lahko poveže z zaporedjem matične zanke med reverzno transkripcijo, skupna dolžina pa lahko doseže 70 bp, kar je v skladu z dolžino pomnoženega produkta, določenega s qPCR.Zasnova temeljnega premaza miRNA v repu.
Zaznavanje, specifično za ojačanje:
Spletna zbirka podatkov o razstrelitvi: razstrelitev CottonFGD po podobnosti zaporedja
Lokalno razstreljevanje: glejte uporabo Blast+ za lokalno razstreljevanje, linux in macos lahko neposredno vzpostavita lokalno bazo podatkov, sistem win10 je mogoče izvesti tudi po namestitvi ubuntu bash.Ustvarite lokalno bazo podatkov o eksplozijah in lokalno eksplozijo;odprite ubuntu bash na win10.
Opomba: bombaž gorskega območja in bombaž morskega otoka sta tetraploidni poljščini, zato bosta posledica pihanja pogosto dve ali več ujemanj.V preteklosti je uporaba CD-jev NAU kot podatkovne baze za izvedbo eksplozije verjetno našla dva homologna gena z le nekaj razlikami SNP.Običajno dveh homolognih genov ni mogoče ločiti z zasnovo primerja, zato se obravnavata kot enaka.Če obstaja očiten vložek, je začetni premaz običajno zasnovan na vložku, vendar lahko to privede do sekundarne strukture temeljnega premaza. Prosta energija postane višja, kar povzroči zmanjšanje učinkovitosti ojačanja, vendar je to neizogibno.

Odkrivanje sekundarne strukture primerja:
Koraki:odpri oligo 7 → vnesite zaporedje predloge → zaprite podokno → shrani → poiščite primer na predlogi, pritisnite ctrl+D, da nastavite dolžino primerja → analizirajte različne sekundarne strukture, kot so samodimerizacijsko telo, heterodimer, lasnica, neusklajenost itd. Zadnji dve sliki na sliki 4 sta rezultati testiranja primerjev.Rezultat sprednjega primerja je dober, ni očitne dimerne in lasne strukture, ni neprekinjenih komplementarnih baz in absolutna vrednost proste energije je manjša od 4,5, medtem ko zadnji primer kaže neprekinjeno. 6 baz je komplementarnih, prosta energija pa je 8,8;poleg tega se na 3' koncu pojavi resnejši dimer in pojavi se dimer 4 zaporednih baz.Čeprav prosta energija ni visoka, lahko 3′ dimer Chl resno vpliva na specifičnost ojačanja in učinkovitost ojačanja.Poleg tega je treba preveriti lasnice, heterodimerje in neskladja.

Slika 3 rezultati odkrivanja oligo7
Zaznavanje učinkovitosti ojačanja:
Učinkovitost pomnoževanja reakcije PCR resno vpliva na rezultate PCR.Tudi pri qRT-PCR je učinkovitost pomnoževanja še posebej pomembna za kvantitativne rezultate.Odstranite druge snovi, stroje in protokole v reakcijskem pufru.Kakovost primerjev ima velik vpliv tudi na učinkovitost pomnoževanja qRT-PCR.Da bi zagotovili točnost rezultatov, morata kvantifikacija relativne fluorescence in kvantifikacija absolutne fluorescence zaznati učinkovitost pomnoževanja primerjev.Znano je, da je učinkovita učinkovitost pomnoževanja qRT-PCR med 85 % in 115 %.Obstajata dve metodi:
1. Metoda standardne krivulje:
a.Zmešajte cDNA
b.Gradientno redčenje
c.qPCR
d.Enačba linearne regresije za izračun učinkovitosti ojačanja
2. LinRegPCR
LinRegPCR je program za analizo podatkov RT-PCR v realnem času, imenovanih tudi kvantitativni podatki PCR (qPCR), ki temelji na SYBR Green ali podobni kemiji.Program uporablja podatke, ki niso popravljeni po osnovni liniji, izvede popravek osnovne linije za vsak vzorec posebej, določi okno linearnosti in nato uporabi analizo linearne regresije, da se prilega ravni črti skozi nabor podatkov PCR.Iz naklona te črte se izračuna učinkovitost PCR vsakega posameznega vzorca.Srednja učinkovitost PCR na pomnožek in vrednost Ct na vzorec se uporabita za izračun začetne koncentracije na vzorec, izražene v poljubnih fluorescenčnih enotah.Vnos in izpis podatkov poteka preko Excelove preglednice.Samo vzorec
potrebno je mešanje, brez gradienta
koraki so potrebni:(Vzemite Bole CFX96 kot primer, ni povsem stroj z jasnim ABI)
poskus:to je standardni poskus qPCR.
Izhod podatkov qPCR:LinRegPCR lahko prepozna dve obliki izhodnih datotek: RDML ali rezultat kvantifikacije Amplifikacije.Pravzaprav je to vrednost zaznavanja števila ciklov in fluorescenčnega signala v realnem času s strani stroja, ojačanje pa se pridobi z analizo vrednosti spremembe fluorescence učinkovitosti linearnega segmenta.
Izbor podatkov: Teoretično bi morala biti vrednost RDML uporabna.Ocenjuje se, da je težava mojega računalnika v tem, da programska oprema ne more prepoznati RDML, zato imam izhodno vrednost excel kot izvirne podatke.Priporočljivo je, da najprej izvedete grob pregled podatkov, na primer neuspešno dodajanje vzorcev itd. Točke lahko izbrišete v izhodnih podatkih (seveda jih ne morete izbrisati, LinRegPCR bo te točke prezrl v poznejši fazi)

Slika 5 Izvoz podatkov qPCR

Slika 6 izbor kandidatnih vzorcev

Vnos podatkov:Odprite qualification amplification results.xls, → odprite LinRegPCR → datoteko → branje iz excela → izberite parametre, kot je prikazano na sliki 7 → V redu → kliknite določite osnovne črte

Slika 7 koraki vnosa podatkov linRegPCR

rezultat:Če ni ponavljanja, združevanje ni potrebno.Če pride do ponavljanja, lahko združevanje uredite v združevanju vzorcev in ime gena vnesete v identifikator, nato pa bo isti gen samodejno združen.Na koncu kliknite datoteko, izvozite excel in si oglejte rezultate.Prikazana bosta učinkovitost pomnoževanja in rezultati R2 vsake vdolbinice.Drugič, če se razdelite v skupine, bo prikazana popravljena povprečna učinkovitost ojačanja.Zagotovite, da je učinkovitost ojačanja vsakega primerja med 85 % in 115 %.Če je prevelik ali premajhen, pomeni, da je učinkovitost ojačanja primerja slaba.

Slika 8 Rezultat in izhod podatkov

Eksperimentalni postopek:
Zahteve glede kakovosti RNA:
Čistost:1.72.0 pomeni, da lahko obstaja ostanek izotiocianata.Čista nukleinska kislina A260/A230 mora biti okoli 2. Če obstaja močna absorpcija pri 230 nm, to pomeni, da obstajajo organske spojine, kot so fenatni ioni.Poleg tega ga je mogoče zaznati z elektroforezo v 1,5 % agaroznem gelu.Pokažite marker, ker ssRNA nima denaturacije in logaritem molekulske mase ni linearen, zato molekulske mase ni mogoče pravilno izraziti.Koncentracija: Teoretičnonemanj kot 100 ng/ul, če je koncentracija prenizka, je čistost na splošno nizka in ne visoka

Slika 9 RNA gel

Poleg tega, če je vzorec dragocen in je koncentracija RNA visoka, je priporočljivo, da ga po ekstrakciji alikvotirate in razredčite RNA do končne koncentracije 100–300 ng/ul za reverzno transkripcijo.notriproces reverzne transkripcije, ko se mRNA prepisuje, se za reverzno transkripcijo uporabljajo oligo (dt) primerji, ki se lahko specifično vežejo na repke poliA, medtem ko lncRNA in circRNA uporabljata naključne heksamerne (Random 6 mer) začetnike za reverzno transkripcijo celotne RNK.Številna podjetja so dala na trg posebne komplete za rep.Za metodo stem-loop je metoda repa bolj priročna, zmogljivejša in prihrani reagente, vendar učinek razlikovanja miRNA iz iste družine ne bi smel biti tako dober kot metoda stem-loop.Vsak komplet za reverzno transkripcijo ima zahteve glede koncentracije gensko specifičnih primerjev (stebelnih zank).Notranja referenca, uporabljena za miRNA, je U6.V procesu inverzije stebla-zanke je treba cev U6 obrniti ločeno, sprednji in zadnji temeljni premaz U6 pa dodati neposredno.Tako circRNA kot lncRNA lahko uporabljata HKG kot notranjo referenco.notridetekcija cDNA,
če ni problema z RNA, bi morala biti tudi cDNA v redu.Če pa si prizadevamo za popolnost poskusa, je najbolje uporabiti notranji referenčni gen (Reference gene, RG), ki lahko razlikuje gDNA od cd.Na splošno je RG gospodinjski gen., HKG), kot je prikazano na sliki 10;Takrat sem izdeloval sojine skladiščne beljakovine in kot interno referenco uporabil introne, ki vsebujejo aktin7.Velikost pomnoženega fragmenta tega primerja v gDNA je bila 452 bp, če je bila cDNA uporabljena kot matrica, pa 142 bp.Nato so rezultati testa ugotovili, da je bil del cDNA dejansko kontaminiran z gDNA, prav tako pa je dokazano, da ni bilo težav z rezultatom reverzne transkripcije in bi ga lahko uporabili kot predlogo za PCR.Neuporabno je izvajati elektroforezo v agaroznem gelu neposredno s cDNA in je razpršen pas, kar ni prepričljivo.

Slika 10 odkrivanje cDNA

Določitev pogojev qPCRna splošno ni težav glede na protokol kompleta, predvsem v koraku vrednosti tm.Če nekateri primerji niso dobro zasnovani med načrtovanjem primerjev, kar povzroči veliko razliko med vrednostjo tm in teoretičnimi 60 °C, je priporočljivo, da cDNA. Ko so vzorci premešani, zaženite gradientno PCR s primerji in se poskušajte izogniti nastavitvi temperature brez trakov kot vrednosti TM.

Analiza podatkov

Običajna metoda kvantitativne PCR relativne fluorescence je v bistvu v skladu z 2-ΔΔCT.Predloga za obdelavo podatkov.

Podobni izdelki:

Enostaven PCR v realnem času^TM –Taqman

Enostaven PCR v realnem času^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix za sintezo prve verige cDNA)

RT Easy II (glavna predmešanica za sintezo prve verige cDNA za qPCR)