Fluorescenčni kvantitativni PCR (znan tudi kot TaqMan PCR, v nadaljevanju FQ-PCR) je nova kvantitativna tehnologija nukleinske kisline, ki jo je razvil PE (Perkin Elmer) v Združenih državah leta 1995. Ta tehnologija temelji na konvencionalni PCR z dodajanjem fluorescentno označenih sond.V primerjavi s prilagodljivim PCR ima FQ-PCR veliko prednosti pri uresničevanju svoje kvantitativne funkcije.Ta članek namerava na kratko opisati značilnosti, načela, metode in aplikacije tehnologije.
1 Lastnosti
FQ-PCR nima samo visoke občutljivosti običajne PCR, ampak tudi zaradi uporabe fluorescentnih sond lahko neposredno zazna spremembo fluorescenčnega signala med pomnoževanjem PCR prek fotoelektričnega prevodnega sistema, da dobi kvantitativne rezultate, kar premaga številne pomanjkljivosti običajne PCR, zato ima tudi visoko specifičnost hibridizacije DNK in visoko natančnost tehnologije spektroskopije.
Na primer, splošne produkte PCR je treba opazovati z elektroforezo v agaroznem gelu in obarvanjem z etidijevim bromidom z ultravijolično svetlobo ali z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu in obarvanjem s srebrom.To ne zahteva le več instrumentov, ampak zahteva tudi čas in trud.Uporabljeni madeži Etidijev bromid so škodljivi za človeško telo, ti zapleteni eksperimentalni postopki pa ponujajo možnosti za onesnaženje in lažne pozitivne rezultate.Vendar pa mora FQ-PCR samo enkrat odpreti pokrov med nalaganjem vzorca, nadaljnji postopek pa je delovanje v popolnoma zaprti epruveti, ki ne zahteva naknadne obdelave PCR, s čimer se izognemo številnim pomanjkljivostim običajnih postopkov PCR.Poskus običajno uporablja termični cikler ABI7100 PCR, ki ga je razvilo podjetje PE.
Instrument ima naslednje značilnosti: ① Široka uporaba: Uporablja se lahko za kvantifikacijo produktov PCR DNA in RNA, raziskave izražanja genov, odkrivanje patogenov in optimizacijo pogojev PCR.② Edinstveno kvantitativno načelo: z uporabo fluorescentno označenih sond se količina fluorescence kopiči s ciklom PCR po laserskem vzbujanju, da se doseže namen kvantifikacije.③ Visoka delovna učinkovitost: vgrajen 9600 PCR termični cikler, računalniško voden 1 do 2 uri za samodejno in sinhrono dokončanje pomnoževanja in kvantifikacije 96 vzorcev.④ Ni potrebe po gelski elektroforezi: Ni potrebe po redčenju in elektroforezi vzorca, samo uporabite posebno sondo za zaznavanje neposredno v reakcijski epruveti.⑤Brez onesnaževanja v cevovodu: Sprejeta sta edinstvena popolnoma zaprta reakcijska cev in fotoelektrični prevodni sistem, tako da ni treba skrbeti za onesnaženje.⑥Rezultati so ponovljivi: kvantitativni dinamični razpon je do pet velikosti.Odkar je bila ta tehnologija uspešno razvita, jo cenijo številni znanstveni raziskovalci in se uporablja na številnih področjih.
2 Načela in metode
Načelo delovanja FQ-PCR je uporaba 5′→3′ eksonukleazne aktivnosti encima Taq za dodajanje fluorescentno označene sonde v reakcijski sistem PCR.Sonda se lahko specifično hibridizira s predlogo DNK, ki jo vsebuje zaporedje primerja.5′-konec sonde je označen z genom za fluorescenčno emisijo FAM (6-karboksifluorescein, vrh fluorescenčne emisije pri 518 nm), 3′-konec pa je označen s skupino za dušenje fluorescence TAMRA (6-karboksitetrametilrodamin, vrh fluorescenčne emisije pri 582 nm), 3′-začetek sonde je fosforiliran, da prepreči podaljšanje sonde med pomnoževanjem PCR.Ko sonda ostane nedotaknjena, dušilna skupina zaduši fluorescenčno emisijo oddajne skupine.Ko je oddajna skupina ločena od dušilne skupine, se inhibicija prekine in optična gostota pri 518 nm se poveča in jo zazna sistem za zaznavanje fluorescence. V fazi renaturacije se sonda hibridizira s šablonsko DNK in encim Taq v ekstenzijski fazi se premika vzdolž šablone DNK s podaljškom primerja.Ko je sonda odrezana, se sprosti učinek dušenja in fluorescentni signal.Vsakič, ko se predloga kopira, se sonda odreže, spremlja pa jo sproščanje fluorescentnega signala.Ker obstaja razmerje ena proti ena med številom sproščenih fluoroforjev in številom produktov PCR, je to tehniko mogoče uporabiti za natančno kvantifikacijo predloge.Eksperimentalni instrument na splošno uporablja termični cikler ABI7100 PCR, ki ga je razvilo podjetje PE, lahko pa se uporabljajo tudi drugi termični ciklerji.Če se za poskus uporabi reakcijski sistem tipa ABI7700, se lahko po končani reakciji kvantitativni rezultati podajo neposredno z računalniško analizo.Če uporabljate druge termociklerje, morate za izračun RQ+, RQ-, △RQ hkrati uporabiti fluorescenčni detektor za merjenje fluorescenčnega signala v reakcijski cevi.RQ+ predstavlja razmerje med intenzivnostjo luminiscence skupine fluorescentnih emisij epruvete z vzorcem in intenzivnostjo luminescence skupine za dušenje, RQ- predstavlja razmerje med obema v slepi epruveti, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) predstavlja količino spremembe fluorescenčnega signala med PCR. Po obdelavi podatkov je mogoče pridobiti kvantitativne rezultate.Zaradi uvedbe fluorescentnih sond se bistveno izboljša specifičnost eksperimenta.Zasnova sonde mora na splošno izpolnjevati naslednje pogoje: ①Dolžina sonde mora biti približno 20-40 baz, da se zagotovi specifičnost vezave.②Vsebnost GC baz je med 40 % in 60 %, da se prepreči podvajanje posameznih nukleotidnih zaporedij.③ Izogibajte se hibridizaciji ali prekrivanju s primerji.④ Stabilnost vezave med sondo in šablono je večja od stabilnosti vezave med primerjem in šablono, zato mora biti vrednost Tm sonde vsaj 5 °C višja od vrednosti Tm primerja.Poleg tega koncentracija sonde, homologija med sondo in vzorčnim zaporedjem ter razdalja med sondo in primerjem vplivajo na eksperimentalne rezultate.
Podobni izdelki:
Kitajska PCR v realnem času Easyᵀᴹ-Taqman Proizvajalec in dobavitelj |Foregene (foreivd.com)
Čas objave: 15. oktober 2021
