Eksperiment RT-qPCR vključuje ekstrakcijo RNK in oceno kakovosti, reverzno transkripcijo in tri korake qPCR, vsak korak ima veliko previdnostnih ukrepov, ki jih bomo podrobno predstavili spodaj.

Ⅰ.Ocena kakovosti RNA

V poskusu RT-qPCR je treba po zaključku ekstrakcije RNA oceniti kakovost RNA, nadaljnji poskus pa je mogoče izvesti šele, ko je kvalificiran.Metode vrednotenja vključujejo spektrofotometer, gelsko elektroforezo Agilent, analizo Agilent 2100, med katerimi sta najpogosteje uporabljena spektrofotometer in detekcijska metoda elektroforeze v agaroznem gelu.Opozoriti je treba, da je treba ti dve metodi uporabljati skupaj za dokončanje odkrivanja in analize koncentracije, čistosti in celovitosti RNA, da se zagotovi kakovost RNA.

Sorodni komplet za izolacijo RNA: 

Cell Total RNA Isolation Kit

Visoko prečiščeno in visokokakovostno celotno RNK je mogoče pridobiti iz različnih gojenih celic v 11 minutah.

Komplet za izolacijo celotne živalske RNA

Hitro in učinkovito ekstrahirajte visoko čisto in kakovostno skupno RNK iz različnih živalskih tkiv.

Spektrofotometer:

Spektrofotometer se uporablja predvsem za določanje koncentracije in čistosti RNA, vendar ne more zaznati celovitosti RNA in genomskega ostanka.Med njimi sta A260/280 in A260/230 pomembna parametra za odkrivanje čistosti RNA, čistost RNA pa je mogoče zaznati glede na nihanje njunih vrednosti:

1. 1,9 < A260/280 < 2,1, kar kaže, da je čistost RNA dobra;A260/280<1,9, kar kaže, da je lahko proteinski ostanek v RNA;A260/280>2.1, kar kaže na možno delno razgradnjo RNA, kar lahko dodatno potrdimo z elektroforezo v agaroznem gelu.

2. 2,0 < A260/230 < 2,2, kar kaže, da je čistost RNA dobra;A260/230< 2,0, kar kaže, da so lahko ostanki organskih reagentov v RNA, kot so fenoli, etanol ali sladkorji.

Elektroforeza v agaroznem gelu:

Test elektroforeze v agaroznem gelu lahko analizira celovitost RNA, genom in beljakovinske ostanke, vendar ne more natančno kvantificirati koncentracije RNA ali zaznati ostankov organskih reagentov.Vzemimo za primer predloge evkariontske RNA:

1. RNA je bila izpostavljena elektroforezi v agaroznem gelu.Če so bili na zemljevidu gela samo trije posamezni pasovi 28sRNA, 18sRNA in 5,8sRNA, to pomeni, da je ekstrahirana RNA nedotaknjena.Če pride do pojava vlečenja, to kaže na delno razgradnjo RNA.

2. Če obstaja en sam svetel trak med luknjo za lepilo in pasom 28sRNA, je morda ostanek genomske DNA.

3. Če se v luknji za lepilo pojavijo trakovi, to pomeni, da so morda ostanki beljakovin in drugih makromolekularnih snovi.

Ⅱ. Povratni prepis

Ko je ekstrakcija RNA končana, jo je treba spremeniti v cDNA za nadaljnje poskuse, zato je korak obračanja bistven.Reverzna transkripcija bo predstavljena z izbiro reverzne transkriptaze in primerja:

Izbira reverzne transkriptaze:

Tipične reverzne transkriptaze vključujejo AMV RTase in MMLV RTase.RNaza H AMV RTase ima močno aktivnost, kratko dolžino sinteze, nizko količino sinteze in dobro toplotno stabilnost (42 ~ 55 ℃).Aktivnost RNaze H MMLV RTase je šibka, dolžina sinteze je dolga, količina sinteze je visoka in toplotna stabilnost je slaba (37 ~ 42 ℃).

Ker ima encim RNaza H funkcijo razgradnje predloge RNA, je treba med reverzno transkripcijo prednostno izbrati MMLV s šibko aktivnostjo RNaze H, po kasnejšem genskem inženiringu pa je termična stabilnost MMLV dosegla kvalitativni skok.Jemanje ForegeneReverzna transkriptaza Foreasy (M-MLV za reverzno transkripcijo) na primer, to je nova reverzna transkriptaza, izražena v bakterijah E. coli, proizvedenih z uporabo tehnologije genske rekombinacije.Je rekombinantna DNA polimeraza, ki sintetizira komplementarno DNA verigo iz enoverižne RNA, DNA ali hibrida RNA:DNA.Nima aktivnosti RNaze H, ima močno stabilnost, močno afiniteto za RNA in visoko občutljivost za zaznavanje.

 

Reverzna transkriptaza Foreasy (M-MLV za reverzno transkripcijo)

Izbira temeljnega premaza:

Na splošno RT primerji spadajo v tri kategorije: oligo dT, naključni primerji in gensko specifični primerji.Izberite ustrezne primerje za uporabo v skladu z različnimi eksperimentalnimi zahtevami.

1. Če je predloga evkariontskega izvora in se pozna cDNA uporablja za rutinsko pomnoževanje PCR, se priporoča Oligo (dT);Če se naslednji poskus uporablja samo za qPCR, je priporočljivo mešati Oligo (dT) z naključnimi primerji za izboljšanje učinkovitosti reverzne transkripcije.

2. Če je predloga iz prokariontov, je treba za reverzno transkripcijo izbrati naključne primerje ali gensko specifične primerje.

Ⅲ.qPCR

Kvantifikacija fluorescence je v glavnem izdelana iz izbire kvantitativnih metod, načel oblikovanja primerja, izbire ROX, konfiguracije reakcijskega sistema in nastavitve reakcijskih pogojev itd.

Izbira kvantitativnih metod:

Kvantitativne metode delimo na relativne kvantitativne metode in absolutne kvantitativne metode.Relativno kvantifikacijo je mogoče uporabiti za odkrivanje učinka določenih metod zdravljenja na izražanje genov, odkrivanje razlike v izražanju genov ob različnih časih in primerjavo razlik v izražanju genov v različnih tkivih.Absolutna kvantifikacija lahko zazna količino nukleinske kisline v virusu in tako naprej.Pri izvajanju poskusov moramo izbrati ustrezne kvantitativne metode glede na lastne poskuse.

Načela oblikovanja temeljnega premaza:

Zasnova primerja za qPCR je neposredno povezana z učinkovitostjo pomnoževanja in specifičnostjo izdelka.Zato je pravilno oblikovanje dobrih primerjev prvi korak uspešnega qPCR.Pri oblikovanju temeljnega premaza je treba pri izpolnjevanju načela običajnega oblikovanja temeljnega premaza upoštevati naslednja načela:

1. Dolžina ciljnega fragmenta je nadzorovana med 100 in 300 bp;

2. Navzkrižno eksonska zasnova za izogibanje vplivu genomske DNA;

3. Načrtovane primerje je treba testirati glede učinkovitosti pomnoževanja in šele ko učinkovitost pomnoževanja doseže standard (90-110%), jih je mogoče uporabiti za kvantitativne poskuse;

4. Koncentracija primerja je običajno optimizirana med 0,1 uM in 1,0 uM.

Izbor odROX:

V procesu kvantitativne reakcije lahko ROX enakomerno prilagodi razliko v optični poti, napako pri pipetiranju ali razliko v prostornini, ki jo povzročita izhlapevanje in kondenzacija, s čimer izboljša ponovljivost rezultatov.Vendar je treba upoštevati, da je izbira ROX povezana z instrumentom.Če ima instrument qPCR funkcijo samodejnega popravljanja razlike med luknjami, mu ni treba dodati ROX;sicer mora dodati popravek ROX.Majhni partnerji pri nakupu reagentov morajo biti v skladu z uporabljenim instrumentom, da izberejo pravilen ROX, da se izognejo kasnejšim napakam.

Priprava reakcijskega sistema:

Zaželena sta reakcijska volumna 20 ul in 50 ul.Pri oblikovanju sistema je treba biti pozoren na naslednje zadeve:

1. Reakcijski sistem je treba pripraviti s prezračevanjem v ultra čisti delovni mizi, novi ddH₂O se uporablja za vsak poskus;

2. Vsak poskus mora pripraviti NTC, da preveri, ali je v sistemu onesnaženje, in vsak par primerjev mora opraviti NTC pri pripravi sistema;

3. Za odkrivanje, ali je v matrici RNA ostanek gDNA, je mogoče pripraviti NRT za vsak vzorec za odkrivanje;

4. Pri pripravi sistema je priporočljivo narediti vsaj 3 tehnične ponovitve za en vzorec;

5. Če je predloga cDNA, je priporočljivo razredčiti 5- do 10-krat, da se zmanjša inhibicijski učinek sistema reverzne transkripcije na poskus qPCR.Bolje je raziskati količino predloge glede na gradient, tako da vrednost CT pade med 20-30;

6. Določite zahtevano število reakcij, povečajte za 5-10 % na podlagi števila reakcij in izračunajte številko konfiguracije volumna;

7, sistem je pripravljen z uporabo načela predmešanja, mešanje po centrifugiranju in zagotavljanje brez mehurčkov;

8, Kolikor je mogoče, izberite podporni potrošni material.

Sorodni komplet RT-qPCR