Sterilizacija konic pipet in EP cevi itd.
1. Pripravite 0,1 % (ena tisočinka) DEPC (zelo strupena snov) z deionizirano vodo, jo previdno uporabite v dimni napi in shranite pri 4 °C stran od svetlobe;
DEPC voda je čista voda, obdelana z DEPC in sterilizirana z visoko temperaturo in visokim pritiskom.Preizkušeno je brez RNaze, DNaze in proteinaze.
2. Postavite konico pipete in cev EP v 0,1 % DEPC in zagotovite, da sta konica pipete in cev EP napolnjeni z 0,1 % DEP.
3. Zaščitite pred svetlobo, pustite stati čez noč (12-24h)
4. Škatle s konico in EP cevjo ni treba namočiti v DEPC.Ko grobo odstranite vodo DEPC v konici ali EP cevki, jo zapakirajte in zavijte.
5. 121 stopinj Celzija, 30 min
6. 180 stopinj Celzija, sušimo več ur (vsaj 3 ure)
Opomba: a.Pri delu z DEPC nosite rokavice in maske iz lateksa!b, ali brez DEPC sterilizacije, 130 ℃, 90 min avtoklava (številni laboratoriji visokotemperaturno sterilizacijo dvakrat)
Premisleki o ekstrakciji RNA
Dva glavna pojava neuspešne izolacije tkivne RNA
razgradnja RNA in ostanki nečistoč v tkivih,kar zadeva razgradnjo, si najprej poglejmo, zakaj se RNA, ekstrahirana iz gojenih celic, ne razgradi zlahka.Vsi obstoječi reagenti za ekstrakcijo RNA vsebujejo komponente, ki hitro zavirajo RNAzo.Dodajte lizat gojenim celicam in ga preprosto premešajte, vse celice lahko temeljito zmešate z lizatom in celice so popolnoma lizirane.Ko so celice lizirane, aktivne sestavine v lizatu takoj zavirajo znotrajcelično RNazo, tako da RNK ostane nedotaknjena.To pomeni, da se njihova RNA zlahka razgradi, ker so gojene celice zlahka in v celoti v stiku z lizatom;po drugi strani pa se RNA v tkivu zlahka razgradi, ker celicam v tkivu ni lahko hitro priti v stik z lizatom.zaradi zadostnega stika.Torej,ob predpostavki, da obstaja način, da tkivo spremenimo v eno samo celico, medtem ko zaviramo aktivnost RNA, bi lahko problem razgradnje popolnoma rešili.
Mletje s tekočim dušikom je najučinkovitejša taka metoda.Vendar pa je metoda mletja s tekočim dušikom zelo težavna, zlasti če je število vzorcev veliko.To je povzročilo naslednjo najboljšo stvar: homogenizator.ThehomogenizatorMetoda ne obravnava vprašanja, kako je aktivnost RNaze inhibirana, preden pridejo celice v stik z lizatom, ampak raje moli, da je stopnja prekinitve tkiva hitrejša od hitrosti, pri kateri znotrajcelična RNaza razgradi RN.
Učinek električnega homogenizatorja je boljši,in učinek steklenega homogenizatorja je slab, vendar na splošno metoda homogenizatorja ne more preprečiti pojava razgradnje.Zato je treba, če je ekstrakcija degradirana, uporabiti originalni električni homogenizator za mletje s tekočim dušikom;prvotni stekleni homogenizator je treba zamenjati z električnim homogenizatorjem ali neposredno zmleti s tekočim dušikom.Problem je skoraj 100% izvedljiv.rešiti se.
Problem ostankov nečistoč, ki vpliva na nadaljnje poskuse, ima več različnih vzrokov kot razgradnja, zato so rešitve temu primerno različne.V zaključku,če pride do razgradnje ali preostalih nečistoč v tkivu, je treba metodo ekstrakcije/reagent za določen poskusni material optimizirati.Za optimizacijo vam ni treba uporabiti svojih dragocenih vzorcev: na tržnici lahko kupite nekaj majhnih živali, kot so ribe/piščanci, vzamete ustrezen del materiala za ekstrakcijo RNA, drugi del pa za ekstrakcijo beljakovin – zmeljete z izvlečkom ust, želodca in črevesja.
Ciljna RNA ekstrahirane RNA se uporablja za različne nadaljnje poskuse, njene zahteve glede kakovosti pa so različne
konstrukcija knjižnice cDNA zahteva celovitost RNA brez ostankov zaviralcev encimske reakcije;Northern zahteva višjo celovitost RNA in nižje zahteve za ostanke inhibitorjev encimskih reakcij;RT-PCR ne zahteva previsoke celovitosti RNA,vendar zavira encimske reakcije.Zahteve glede ostankov so stroge.Vhod določa izhod;vsakič, ko je cilj pridobiti RNK najvišje čistosti, bo to stalo ljudi in denarja.
Zbiranje/shranjevanje vzorcev
Dejavniki, ki vplivajo na razgradnjo Ko vzorec zapusti živo telo/ali prvotno rastno okolje, bodo endogeni encimi v vzorcu začeli razgrajevati RNA,hitrost razgradnje pa je povezana z vsebnostjo endogenih encimov in temperaturo.Tradicionalno obstajata samo dva načina za popolno inhibicijo endogene encimske aktivnosti: takoj dodajte lizat in temeljito in hitro homogenizirajte;narežemo na majhne koščke in takoj zamrznemo v tekočem dušiku.Oba pristopa zahtevata hitro delovanje.Slednji je primeren za vse vzorce, prvi pa le za tkiva z nizko vsebnostjo celic in endogenih encimov ter jih je lažje homogenizirati.Natančneje, rastlinsko tkivo, jetra, priželjc, trebušno slinavko, vranico, možgane, maščobo, mišično tkivo itd. je najbolje pred nadaljevanjem zamrzniti s tekočim dušikom.
Fragmentacija in homogenizacija vzorcev
Dejavniki, ki vplivajo na razgradnjo in donos Fragmentacija vzorca jeza popolno homogenizacijo, ki je za popolno in popolno sprostitev RNA.Celice je mogoče neposredno homogenizirati, ne da bi jih zlomili.Tkiva se lahko homogenizirajo šele po lomljenju.Kvas in bakterije je treba pred homogenizacijo razbiti z ustreznimi encimi.Tkiva z nižjo vsebnostjo endogenih encimov in lažjo homogenizacijo lahko naenkrat zdrobimo in homogeniziramo v lizatu s homogenizatorjem;rastlinsko tkivo, jetra, priželjc, trebušna slinavka, vranica, možgani, maščoba, mišično tkivo in drugi vzorci, imajo visoko vsebnost endogenih encimov ali pa jih ni enostavno homogenizirati,zato je treba prekinitev tkiva in homogenizacijo izvesti ločeno.Najbolj zanesljiv in najproduktivnejši način drobljenja je mletje s tekočim dušikom, najbolj zanesljiv način homogenizacije pa je uporaba električnega homogenizatorja.Posebna opomba glede mletja s tekočim dušikom: vzorca med celotnim postopkom mletja ne smemo odmrzniti, saj je večja verjetnost, da bodo endogeni encimi delovali, ko bo zamrznjen.
Izbira lizata
Vpliv na udobje delovanja in dejavniki preostalih endogenih nečistoč Običajno uporabljene raztopine za lizo lahko skoraj zavirajo aktivnost RNaze.Zato je ključna točka izbire raztopine za lizo upoštevati v kombinaciji z metodo čiščenja.Obstaja ena izjema:pri vzorcih z visoko vsebnostjo endogenih encimov je priporočljiva uporaba lizata, ki vsebuje fenol, da se poveča sposobnost inaktivacije endogenih encimov.
Izbira metode čiščenja
Dejavniki, ki vplivajo na preostale endogene nečistoče, hitrost ekstrakcije Za čiste vzorce, kot so celice, je mogoče doseči zadovoljive rezultate s skoraj vsako razpoložljivo metodo čiščenja.Toda za številne druge vzorce, zlasti tiste z visoko vsebnostjo nečistoč, kot so rastline, jetra, bakterije itd., je izbira primerne metode čiščenja ključna.Centrifugalna metoda čiščenja s kolono ima hitro ekstrakcijsko hitrost in lahko učinkovito odstrani nečistoče, ki vplivajo na poznejšo encimsko reakcijo RNA, vendar je draga (Foregene lahko ponudi stroškovno učinkovite komplete, več podrobnosti kliknitetukaj);z uporabo ekonomičnih in klasičnih metod čiščenja, kot je obarjanje LiCl, lahko dobimo tudi zadovoljive rezultate, vendar je čas delovanja dolg..
"Tri discipline in osem pozornosti" za ekstrakcijo RNK
Disciplina 1:Končajte kontaminacijo eksogenih encimov.
Opomba 1:Strogo nosite maske in rokavice.
Opomba 2:Centrifugalne epruvete, glave konic, palice za pipete, posode za elektroforezo in poskusne mize, ki so vključene v poskus, je treba temeljito odstraniti.
Opomba 3:Reagenti/raztopine, vključene v poskus, zlasti voda, ne smejo vsebovati RNaze.
Disciplina 2:Blokirajte aktivnost endogenih encimov
Opomba 4:Izberite ustrezno metodo homogenizacije.
Opomba 5:Izberite ustrezen lizat.
Opomba 6:Kontrolirajte začetno količino vzorca.
Disciplina 3:Pojasnite svoj namen pridobivanja
Opomba 7:Ko se kateri koli lizatni sistem približuje največji začetni količini vzorca, se stopnja uspešnosti ekstrakcije močno zmanjša.
Opomba 8:Edino ekonomsko merilo za uspešno ekstrakcijo RNK je uspeh v nadaljnjih poskusih, ne izkoristek.
10 najpogostejših virov kontaminacije z RNazo
1. Prsti so prvi vir eksogenih encimov, zato je treba rokavice pogosto nositi in menjati.Poleg tega je treba nositi tudi maske, saj je tudi dihanje pomemben vir encimov.Dodatna prednost nošenja zaščitne maske je zaščita eksperimentatorja.
2. Konice pipet, centrifugalne epruvete, pipete – RNaze ni mogoče inaktivirati samo s sterilizacijo, zato je treba konice pipet in centrifugalne epruvete obdelati z DEPC, tudi če so označeni kot obdelani z DEPC.Najbolje je uporabiti namensko pipeto, ki jo pred uporabo obrišemo z 75% alkoholno vato, še posebej paličico;poleg tega pazite, da ne uporabite odstranjevalca glave.
3. Voda/pufer ne sme biti kontaminiran z RNazo.
4. Vsaj testno mizo obrišite s 75% alkoholnimi bombažnimi kroglicami.
5.Endogena RNaza Vsa tkiva vsebujejo endogene encime, zato je hitro zamrzovanje tkiv s tekočim dušikom najboljši način za zmanjšanje razgradnje.Metoda shranjevanja/mletja s tekočim dušikom je res neprijetna, vendar je to edina pot za tkiva z visoko vsebnostjo endogenih encimov.
6. Vzorci RNA Izdelki za ekstrakcijo RNA lahko vsebujejo sledove kontaminacije z RNazo.
7. Ekstrakcija plazmida Ekstrakcija plazmida pogosto uporablja Rnazo za razgradnjo RNK, preostalo Rnazo pa je treba razgraditi s proteinazo K in ekstrahirati s PCI.
8. Shranjevanje RNK Tudi če je shranjena pri nizki temperaturi, bodo količine RNK v sledovih povzročile razgradnjo RNK.Najboljša rešitev za dolgoročno ohranitev RNK je sol/alkoholna suspenzija, saj alkohol pri nizkih temperaturah zavre vso encimsko aktivnost.
9. Ko kationi (Ca, Mg) vsebujejo te ione, bo segrevanje pri 80 C za 5 minut povzročilo cepitev RNA, tako da, če je treba RNA segreti, mora raztopina za konzerviranje vsebovati kelatno sredstvo (1 mM natrijevega citrata, pH 6,4).
10. Encimi, uporabljeni v naslednjih poskusih, so lahko kontaminirani z RNazo.
10 nasvetov za ekstrakcijo RNA
1: Hitro preprečite aktivnost RNaze.Vzorci se po zbiranju hitro zamrznejo, RNaza pa se inaktivira s hitrim delovanjem med lizo.
2: Izberite ustrezno metodo ekstrakcije za tkivo z visoko vsebnostjo ribozima, za maščobno tkivo pa je najbolje uporabiti metodo, ki vsebuje fenol.
3: Kakovost napovedi zahteva Northern, konstrukcija knjižnice cDNA zahteva visoko integriteto, RT-PCR in RPA (preizkus zaščite z ribonukleazo) pa ne zahtevata visoke integritete.RT-PCR zahteva visoko čistost (ostanki inhibitorjev encimov).
4: Temeljita homogenizacija je ključ do izboljšanja donosa in zmanjšanja razgradnje.
5: Preverite celovitost detekcije elektroforeze RNA, 28S: 18S = 2: 1 je popoln znak, 1: 1 je prav tako sprejemljivo za večino poskusov.
6: Odstranitev DNA za RT-PCR, analiza nizov Za odstranitev DNA je najbolje uporabiti Dnase I.
7: Zmanjšajte kontaminacijo eksogenih encimov – encimov ni mogoče uvoziti od zunaj.
8: Pri koncentriranju nukleinske kisline z nizko koncentracijo je treba dodati reagent za soobarjanje.Toda za preprečitev kontaminacije encimov, ki vsebujejo koprecipitant, in DNA.
9: temeljito raztopite RNA, po potrebi segrevajte pri 65 °C 5 minut.
primeren način shranjevanja
Kratek čas ga lahko hranimo pri –20C, dalj časa pa pri –80C.Prvi korak pri izboljšanju donosa RNK je spoznanje, da se vsebnost RNK v različnih vzorcih zelo razlikuje.Visoka številčnost (2-4ug/mg), kot so jetra, trebušna slinavka, srce, srednja številčnost (0,05-2ug/mg), kot so možgani, zarodki, ledvice, pljuča, timus, jajčniki, nizka številčnost (<0,05ug/mg) mg), kot so mehur, kosti, maščoba.
1: Lizirajte celice za sprostitev RN – če se RNA ne sprosti, se bo izkoristek zmanjšal.Električna homogenizacija deluje bolje kot druge metode homogenizacije, vendar jo bo morda treba kombinirati tudi z drugimi metodami, kot je mešanje s tekočim dušikom, encimska razgradnja (lizocim/litikaza)
2: Optimizacija metode ekstrakcije.Največji problemi pri metodah na osnovi fenola so nepopolna stratifikacija in delna izguba RNA (supernatanta ni mogoče popolnoma odstraniti).Nepopolna stratifikacija je posledica visoke vsebnosti nukleinske kisline in beljakovin, kar je mogoče rešiti s povečanjem količine uporabljenega lizata ali zmanjšanjem količine vzorca.Faza ekstrakcije s kloroformom je bila dodana v maščobno tkivo.Izgubo RNA je mogoče zmanjšati s povratnim črpanjem ali z odstranitvijo organske plasti, ki ji sledi centrifugiranje.Največja težava pri metodah kolonskega centrifugiranja je presežek vzorca.
Klasični nasveti za ekstrakcijo
1. Čiščenje fenola: dodajte enako količino 1:1 fenola/kloroforma in močno mešajte 1-2 minuti.Centrifugirajte pri visoki hitrosti 2 minuti.Previdno odstranite supernatant (80-90 %).Nikoli ne pridite do srednje plasti.Enak volumen reakcijske raztopine lahko dodate fenolu/kloroformu in supernatant odstranite.Oba supernatanta lahko zmešate skupaj za obarjanje nukleinske kisline, da izboljšate izkoristek.Pri mešanju ne bodite preveč nežni in ne poskušajte odstraniti vsega supernatanta.
2. Izpiranje s 70-80 % etanolom: Med izpiranjem je treba nukleinsko kislino suspendirati, da se zagotovi izpiranje ostankov soli.Istočasno takoj po odlivanju etanola nekaj sekund centrifugirajte pri visoki hitrosti in nato s pipeto odstranite preostali etanol.Raztopite po 5-10 minutah mirovanja pri sobni temperaturi.
11. Ekstrakcija posebnih organizacij
1. Vlaknasto tkivo: Ključ do ekstrakcije RNA iz vlaknastega tkiva, kot je srčna/skeletna mišica, je popolna prekinitev tkiva.Ta tkiva imajo nizko celično gostoto, zato je količina RNA na enoto teže tkiva majhna, zato je najbolje uporabiti čim večjo začetno količino.Prepričajte se, da tkivo temeljito zmeljemo v pogojih zamrzovanja.
2. Tkiva z visoko vsebnostjo beljakovin/maščob: vsebnost možganov/rastlinske maščobe je visoka.Po ekstrakciji PCI supernatant vsebuje bele kosmiče.Supernatant je treba ponovno ekstrahirati s kloroformom.
3. Tkiva z visoko vsebnostjo nukleinske kisline/ribozima: vranica/priželjc ima visoko vsebnost nukleinske kisline in ribozima.Mletje tkiva v pogojih zamrzovanja, ki mu sledi hitra homogenizacija, lahko učinkovito inaktivira ribozime.Če pa je lizat preveč viskozen (zaradi visoke vsebnosti nukleinske kisline), ekstrakcija PCI ne bo mogla učinkovito stratificirati;dodajanje več lizata lahko reši to težavo.Več ekstrakcij PCI lahko odstrani več preostale DNK.Če takoj po dodajanju alkohola nastane bela oborina, to kaže na kontaminacijo DNK.Ponovna ekstrakcija s kislim PCI po raztapljanju lahko odstrani kontaminacijo DNK.
4. Rastlinsko tkivo: Rastlinsko tkivo je bolj kompleksno od živalskega.Na splošno se rastline meljejo v pogojih tekočega dušika, zato je razgradnja RNA z endogenimi encimi neobičajna.Če problem razgradnje ni odpravljen, ga skoraj zagotovo povzročajo nečistoče v vzorcu.Nečistoče, ki jih vsebujejo številne rastline, bodo povzročile ostanke, razlog za ostanke pa je pogosto, ker imajo te nečistoče nekaj podobnosti z RNK: ti obarjaš in jaz obarjam, ti adsorbiraš in jaz adsorbiram.Te značilnosti določajo, da so zelo močni zaviralci encimov.
Trenutno je komercialne reagente za ekstrakcijo RNA mogoče prilagoditi skoraj vsem živalskim tkivom z majhnimi prilagoditvami, vendar je malo komercialnih reagentov za ekstrakcijo RNA, ki so lahko primerni za večino rastlinskih tkiv.Na srečo lahko Foregene zagotovi posebnekompleti za ekstrakcijo rastlinske RNK, imamoKomplet za izolacijo rastlinske celotne RNK, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Slednji je posebej zasnovan za rastline z visoko vsebnostjo polisaharidov in polifenolov.Za ekstrakcijo RNK so povratne informacije uporabnikov laboratorija še posebej dobre.
12. Učinek zamrzovanja in odmrzovanja vzorca Zamrznjen vzorec je lahko večji in ga je treba razrezati, preden se uporabi za ekstrakcijo RNK.Vzorci se med rezanjem radi stopijo (po možnosti delno).Zamrznjene vzorce bo morda treba stehtati pred ekstrakcijo RNK, med tem postopkom pa bo zagotovo prišlo do odmrzovanja.Včasih pride do odmrzovanja vzorca tudi med postopkom mletja s tekočim dušikom;ali pa se zamrznjen vzorec neposredno doda lizatu brez mletja s tekočim dušikom in bo zagotovo prišlo do odmrzovanja pred popolno homogenizacijo.Poskusi so pokazali, da je zamrznjeno tkivo bolj nagnjeno k razgradnji RNA med odmrzovanjem kot sveže tkivo.Verjeten razlog: Postopek zamrzovanja in odmrzovanja moti strukture v celici, zaradi česar endogeni encimi lažje pridejo v neposreden stik z RNK.
13. Presoja kakovosti RNA Običajno se za presojo celovitosti RNA uporablja elektroforeza, za presojo čistosti RNA pa A260/A280.V teoriji ima nepoškodovana RNA razmerje 28S:18S = 2,7:1, večina podatkov pa poudarja razmerje 28S:18S = 2:1.Dejstvo je, da skoraj nobena RNA, ekstrahirana iz vzorcev razen celic, ni v razmerju 2:1 (to je bilo pridobljeno z Agilent Bioanalyzerjem).
Na rezultate elektroforeze RNA vplivajo številni dejavniki, vključno s sekundarno strukturo, pogoji elektroforeze, obremenitvijo vzorca, stopnjo nasičenosti z EB itd. Uporabite nativno elektroforezo za odkrivanje RNA in uporabite marker DNA kot kontrolo.Če sta 28S pri 2 kb in 18S pri 0,9 kb čista in 28S: 18S > 1, lahko celovitost izpolni zahteve večine nadaljnjih poskusov.
A260/A280 je indikator, ki je povzročil veliko zmede.Najprej je treba razjasniti prvotni pomen tega indikatorja za nukleinske kisline: čista RNA, njen A260/280 = približno 2,0.Čista RNA je 'vzrok' in A260/A280 = 2 je 'posledica'.Zdaj vsi uporabljajo A260/A280 kot 'vzrok' in mislijo, da "če je A260/A280 = 2, potem je RNA čista", kar seveda vodi v zmedo.
Če vas zanima, lahko vzorcu RNA dodate malo reagenta, ki se pogosto uporablja pri ekstrakciji, kot je fenol, gvanidin izotiocianat, PEG itd., in nato izmerite razmerje A260/A280.Resničnost je taka, da veliko reagentov, ki se uporabljajo za ekstrakcijo RNK, kot tudi številne nečistoče v vzorcu absorbirajo okoli A260 in A280, kar vpliva na A260/A280.
Najbolj poučen pristop trenutno je skeniranje vzorcev RNA v območju 200-300 nm.Krivulja čiste RNA ima naslednje značilnosti: krivulja je gladka, A230 in A260 sta dve prevojni točki, A300 je blizu 0, A260/A280 = okoli 2,0 in A260/A230 = okoli 2,0.Če podatki skeniranja niso na voljo, je treba določiti tudi razmerje A260/A230, saj je to razmerje bolj občutljivo na prenos vseh nečistoč, ki vplivajo na encimsko reakcijo.Upoštevajte linearni razpon naprave (0,1–0,5 za A260).
Obstajata še dva uporabna pojava: razmerje bo približno 0,3 nižje, če A260/A280 merimo v vodi;medtem ko je razmerje, izmerjeno v 10 mM EDTA, približno 0,2 višje od tistega, izmerjenega v 1 mM EDTA.
Podobni izdelki:
Serija izolacije RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Čas objave: 15. julij 2022
