Kolona je zamašena

Po zamašitvi kolone je izkoristek RNA zmanjšan ali celo nemogoče očistiti RNA, dobljena masa RNA pa je majhna.

Analiza pogostih vzrokov:

1. Prelomi vzorca niso temeljiti.

Zlom vzorca ne povzroči popolne blokade DNA-CLEANING COLUMN, hkrati pa vpliva na izkoristek in kakovost RNA.Priporočamo hitro mletje v zadostni količini tekočega dušika, ko ste razbili vzorce. Poskusite zdrobiti celično steno vzorca, celično membrano in drugo tkivo.Za rastlinske vzorce poliolnih polisaharidov priporočamo uporabo Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. Pri sesanju ločenega supernatanta vzorca s kolono za čiščenje DNA lahko vdihnete morebitno celično fragmentirano oborino.

Odvzeti fragmentirani sedimenti celic bodo povzročili kolono SAMO RNA, ki bo blokirana, ko bo izvedena operacija adsorpcije RNA (glejte 6. korak).Priporočamo, da pri sesanju tega supernatanta pazljivo preprečite sesanje celičnih ostankov.

3. Začetna količina vzorca je prevelika.

Prekomerna uporaba vzorca bo povzročila nepopolno fragmentacijo vzorca ali nepopolno lizo celic s pufrom PSL1, kar bo povzročilo blokado čistilne kolone med čiščenjem.Komplet za izolacijo celotne rastlinske RNK. Vsak posamezen prečiščen operativni vzorec je 50 mg.Za rastlinske vzorce poliolnih polisaharidov priporočamo, da preizkusite Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. Temperatura centrifuge je prenizka.

Celoten postopek izolacije in čiščenja RNA poteka pri sobni temperaturi (20-25°C), le da se vzorčno tkivo razbije s tekočim dušikom. Temperatura nekaterih kriogenih centrifug je nižja od 20℃, kar lahko povzroči blokado kolone za čiščenje DNA in/ali kolone samo za RNA.Če se to zgodi, nastavite temperaturo centrifuge na 20-25℃, inposkrbite, da sta bila mešanica za lizo in/ali supernatant z dodatkom etanola predhodno segret na 37°C.

RNK ni ekstrahirana ali pa je izkoristek RNK nizek

Običajno obstaja veliko dejavnikov, ki vplivajo na učinkovitost predelave, kot so: vsebnost RNK v vzorcu, metoda delovanja, volumen elucije itd.

Spodnja analiza pogostih vzrokov:

1. Med operacijo je bila izvedena ledena kopel ali centrifugiranje pri nizki temperaturi (4 °C).

Predlog: Delujte pri sobni temperaturi (15-25°C) v celotnem procesu ne izvajajte ledene kopeli in centrifugiranja pri nizki temperaturi.

2. RNA je bila razgrajena zaradi nepravilnega shranjevanja vzorca ali dolgoročnega shranjevanja vzorca.

Priporočilo: Sveže zbrane vzorce je treba na hitro zamrzniti v tekočem dušiku in nato dolgo časa shraniti pri -80 °C, izogibajte se ponovnemu zamrzovanju in odmrzovanju vzorcev;ali vzorce takoj namočite v raztopino RNA stabilizatorja RNAlater (živalski vzorci).

3. Nezadostna fragmentacija vzorca in liza vodita do blokade čistilne kolone.

Predlog: Ko meljete tkivo, se prepričajte, da je tkivo dovolj zmleto, in ga hitro prenesite v vnaprej pripravljen pufer PSL1 (potrdite, da je bil dodan pravi delež β-ME, glejte 1. korak postopka).

4.Eluent je bil dodan nepravilno.

Predlog: Prepričajte se, da ddH2O brez RNaze kaplja na sredino membrane čistilne kolone.

5. Pufru PSL2 ali pufru PRW2 ni bila dodana pravilna količina absolutnega etanola.

Predlog: Sledite navodilom, dodajte pravilno količino absolutnega etanola v pufer PSL2 in pufer PRW2 ter dobro premešajte, preden uporabite komplet.

6. Količina vzorca tkiva je neustrezna.

Predlog: Uporabite 50 mg tkiva na 500 μl pufra PSL1.Uporaba preveč tkiva bo zmanjšala količino ekstrahirane RNA, zmanjšana pa bo tudi čistost nastale RNA.Močno priporočamo, da začetni odmerek vzorca ne sme preseči 50 mg na operacijo ekstrakcije RNK.

7. Neustrezen volumen elucije ali nepopolna elucija.

Predlog: Volumen eluenta čistilne kolone je 50-200 μl;če učinek elucije ni zadovoljiv, je priporočljivo podaljšati čas pri sobni temperaturi po dodajanju predhodno segretega ddH2O brez RNaze, na primer za 5-10 minut.

8. Čistilna kolona ima po izpiranju s pufrom PRW2 ostanek etanola.

Predlog: Če prazno epruveto centrifugirate 1 minuto in po izpiranju v pufru PRW2 še vedno ostane etanol, lahko podaljšate čas centrifugiranja prazne epruvete na 2 minuti ali postavite čistilno kolono na sobno temperaturo za 5 minut, da v celoti odstranite preostali etanol.

9. Komplet je bil uporabljen nepravilno.

Predlog: Za rastlinske vzorce polifenolnih polisaharidov z uporabo običajnih kompletov, kot je Plant Total RNA Isolation Kit, morda ne bo mogoče pridobiti idealnih vzorcev RNA.Priporočamo vam uporabo kompleta Plant Total RNA IsolationKit Plus, ki je posebej zasnovan za rastlinske vzorce polifenolnih polisaharidov.Komplet, posebej razvit za ekstrakcijo RNK iz rastlinskih vzorcev polifenolov in polisaharidov.

Vrednost OD260/OD280 je nizka

Elucija RNK z ddH2O in uporaba za odčitke na spektrofotometru povzroči nizke vrednosti OD260/OD280.Priporočamo uporabo 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (namesto ddH2O brez RNaze za eluiranje RNA), da dobite razmeroma pravilne vrednosti OD260/OD280, glejte »Preizkusi koncentracije in čiščenja RNA« na strani 19.

Očiščena RNA se razgradi

Kakovost prečiščene RNA je povezana z dejavniki, kot so ohranitev vzorca, kontaminacija z RNazo in manipulacija.

Analiza pogostih vzrokov:

1. Vzorci tkiv po odvzemu niso bili pravočasno shranjeni.

Priporočilo: Če vzorcev tkiva ne uporabite pravočasno po odvzemu, jih takoj shranite v tekoči dušik pri nizki temperaturi ali jih po hitrem zamrzovanju v tekočem dušiku prenesite na -80 °C za dolgotrajno shranjevanje ali pa vzorce takoj potopite v raztopino stabilizatorja RNA RNAlater (živalski vzorci).Za ekstrakcijo RNK poskusite uporabiti sveže zbrane vzorce tkiva.

2. Ponavljajoče se zamrzovanje in odmrzovanje vzorcev tkiva.

Predlog: Ko shranjujete vzorce tkiv, je najbolje, da jih razrežete na majhne koščke za konzerviranje in del teh odstranite, ko jih uporabljate, da se izognete razgradnji RNK zaradi ponavljajočega se zamrzovanja in odmrzovanja vzorcev.

3. RNazo vnesemo v operacijski sobi ali ne nosimo rokavic za enkratno uporabo, maske itd.

Predlog: Poskuse ekstrakcije RNK je najbolje izvajati v ločenih operacijah RNK, laboratorijsko mizo pa je treba pred poskusom očistiti, med poskusom pa je treba nositi rokavice in maske za enkratno uporabo, da se v največji meri izognete razgradnji RNK, ki jo povzroči vnos RNaze.

4. Reagent je med uporabo kontaminiran z RNazo.

Predlog: zamenjajte z novo serijo kompletov za ekstrakcijo celotne rastlinske RNK za sorodne poskuse.

5. Centrifugalne epruvete in konice pipet, ki se uporabljajo za manipulacijo RNK, so kontaminirane z RNazo.

Predlog: Prepričajte se, da so centrifugalne epruvete, konice pipet, pipete itd., ki se uporabljajo pri ekstrakciji RNA, brez RNaze.

Navodila za uporabo:

Priročnik z navodili Plant Total RNA Isolation Kit Plus