Bili smo izkušen proizvajalec.Pridobivanje večine v ključnih certifikatih na svojem trgu za veliko znižano Kitajsko visoko občutljivo enostopenjsko sondo Rt-QpcrKit V2, Kakovost je tovarniško življenje, Osredotočenost na povpraševanje strank je vir preživetja in razvoja podjetja, Zavzemamo se za poštenost in odnos do dela v dobri veri, veselimo se vašega prihoda!
Bili smo izkušen proizvajalec.Pridobivanje večine v ključnih certifikatih svojega trga zaKitajska Taq DNA polimeraza, Qpcr, Naše podjetje obljublja: razumne cene, kratek proizvodni čas in zadovoljive poprodajne storitve, vabimo vas tudi, da obiščete našo tovarno kadar koli želite.Želim si, da bi zdaj imeli prijetno in dolgoročno poslovno sodelovanje!!!

Opisi

Ta komplet uporablja edinstven sistem liznega pufra, ki lahko hitro sprosti RNA iz gojenih celičnih vzorcev za reakcije RT-qPCR, s čimer se odpravi zamuden in težaven postopek čiščenja RNA.Predlogo RNA lahko dobite v samo 7 minutah.Reagenti 5×Direct RT Mix in 2×Direct qPCR Mix-SYBR, ki jih dobite v kompletu, lahko hitro in učinkovito pridobijo kvantitativne rezultate PCR v realnem času.

5×Direct RT Mix in 2×Direct qPCR Mix-SYBR imata močno toleranco za inhibitorje, lizat vzorcev pa se lahko uporabi kot predlogo za neposredno RT-qPCR.Ta komplet vsebuje edinstveno reverzno transkriptazo Foregene z visoko afiniteto RNA in DNA polimerazo Hot D-Taq, dNTP, MgCl₂, reakcijski pufer, PCR optimizator in stabilizator.

Specifikacije

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Sestavni deli kompleta

Značilnosti in prednosti

■ Preprosto in učinkovito: s tehnologijo Cell Direct RT lahko vzorce RNA pridobite v samo 7 minutah.

■ Potreba po vzorcu je majhna, testirati je mogoče le 10 celic.

■ Visoka zmogljivost: lahko hitro zazna RNK v celicah, gojenih v ploščah s 384, 96, 24, 12 in 6 jamicami.

■ DNA Eraser lahko hitro odstrani sproščene genome in močno zmanjša vpliv na poznejše eksperimentalne rezultate.

■ Optimiziran sistem RT in qPCR naredi dvostopenjsko reverzno transkripcijo RT-PCR učinkovitejšo, PCR pa bolj specifično in bolj odporno na zaviralce reakcije RT-qPCR.

Aplikacija kompleta

Področje uporabe: gojene celice.

- RNA, sproščena z lizo vzorca: velja samo za predlogo RT-qPCR tega kompleta.

- Komplet se lahko uporablja za naslednje namene: analiza izražanja genov, preverjanje učinka utišanja genov, ki ga posreduje siRNA, presejanje zdravil itd.

Diagram

Shranjevanje in rok uporabnosti

Del I tega kompleta je treba hraniti pri 4 ℃;Del II je treba hraniti pri -20 ℃.

Foregene Protease Plus II shranjujte pri 4 ℃, ne zamrzujte pri -20 ℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR je treba hraniti pri -20 ℃ v temi;če ga pogosto uporabljate, ga lahko shranite tudi pri 4 ℃ za kratkotrajno shranjevanje (porabite v 10 dneh). Smo izkušeni proizvajalec.Osvojil je večino v ključnih certifikatih na svojem trgu za veliko znižanje Kitajska, visoko občutljiva enostopenjska sonda Rt-Qpcr Kit V2, kakovost je tovarniško življenje, osredotočenost na povpraševanje strank je vir preživetja in razvoja podjetja, držimo se poštenosti in dobre vere pri delu, veselimo se vašega prihoda!
Velik popustKitajska Taq DNA polimeraza, Qpcr, Naše podjetje obljublja: razumne cene, kratek proizvodni čas in zadovoljive poprodajne storitve, vabimo vas tudi, da obiščete našo tovarno kadar koli želite.Želim si, da bi zdaj imeli prijetno in dolgoročno poslovno sodelovanje!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.št.DRT-01021/01022

Za celični neposredni RT-qPCR z uporabo ≤ 1000.000 celic

Predstavitev izdelka

Ta izdelek uporablja edinstven sistem liznega pufra za hitro sproščanje RNA iz kultiviranih celičnih vzorcev za reakcije RT-qPCR, s čimer odpravi zamuden in naporen postopek čiščenja RNA in samo 7 minut za pridobitev zahtevane predloge RNA, s 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman, ki ga zagotavlja komplet, lahko hitro in učinkovito pridobi kvantitativne rezultate PCR v realnem času.

5× Direct RT Mix in 2× Direct qPCR Mix-Taqman imata močno toleranco za inhibitorje in lahko izvajata učinkovito obračanje in specifično pomnoževanje z uporabo lizata vzorca, ki ga je treba izmeriti, kot predloge.Reagent vsebuje Foregene reverzno transkriptazo, vročo D-Taq DNA polimerazo, dNTP, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer in Stabilizer, ki se lahko uporablja z liznim pufrom za hitro in preprosto odkrivanje vzorcev in ima značilnosti visoke občutljivosti, specifičnosti in stabilnosti.

Lastnosti izdelka

Enostavna in učinkovita tehnologija Cell Direct RT, ki potrebuje le 7 minut, da pridobi vzorce RNA.

Zahtevani vzorci so majhni in za poskuse je mogoče uporabiti najmanj 10 gojenih celic.

Visoka zmogljivost za hitro pridobivanje RNA gojenih celic, kot so plošče s 384, 96, 24, 12 in 6 vdolbinicami.

DNA Eraser lahko hitro odstrani sproščene genome, kar močno zmanjša vpliv na poznejše eksperimentalne rezultate.

Optimizirana sistema RT in qPCR omogočata dvostopenjski RT-PCR z učinkovitejšo reverzno transkripcijo, specifičnostjo in močnejšo toleranco za inhibitorje reakcije RT-qPCR.

Aplikacija kompleta

Področje uporabe: gojene celice.

RNA, interpretirana z lizo vzorca: uporabljena samo kot dvostopenjska predloga RT-qPCR.

Kompleti se lahko uporabljajo za naslednje namene: analiza izražanja genske regulacije, testiranje alelov, presejanje zdravil itd.

Omejitve kompleta

Pomnoženi fragmenti ≤ 300 bp.

Kompleti se uporabljajo za sveže gojenje celic.

Kontrola kakovosti izdelkov

V skladu s sistemom popolnega upravljanja kakovosti FOREGENE je vsaka serija kompletov serije Cell Direct RT-qPCR večkrat strogo testirana, da se zagotovi zanesljivost in stabilnost kakovosti vsake serije kompletov.

Vsebina kompleta

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman je mogoče kupiti ločeno, podrobnosti so navedene v Dodatku 1 (STRAN 13).

Pogoji shranjevanja

1. Pogoji pošiljanja

Celoten postopek transporta škatle z ledenim paketom pri nizki temperaturi, da se zagotovi, da je komplet v stanju <4 °C.

2. Pogoji shranjevanja

Shranjujte del I pri 4 °C in del II pri -20 °C.

Foregene Protease Plus II shranjujte pri 4 °C, ne zamrzujte pri -20 °C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman se shranjuje pri -20 °C ali pri 4 °C za kratkotrajno uporabo, če se pogosto uporablja (v 10 dneh).

Informacije o komponentah kompleta

Pufer CL: Zagotavlja okolje, potrebno za reakcije celične lize.

Pufer ST: prekine aktivno snov v lizatu, da se izogne ​​učinkom na nadaljnjo RT.

DNA Eraser: odstranjevalec DNK, učinek odstranitve genoma na nadaljnje poskuse.

5× Direct RT Mix: Vsebuje Foregene reverzno transkriptazo z visoko afiniteto do RNA, zaviralec RNAze, dNTP, stabilizatorje, ojačevalce, optimizatorje in primerje za reverzno transkripcijo za optimalno poravnavo (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: V kontekstu liznega pufra se celice lizirajo, da sprostijo nukleinske kisline.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Ta reagent vsebuje vročo D-Taq DNA polimerazo, dNTP, MgCl₂, reakcijski pufer, PCR optimizator in stabilizator.

Referenčno barvilo 20× ROX: običajno se uporablja na instrumentih za pomnoževanje PCR v realnem času ABI, Stratagene in drugih podjetij, uporablja se za prilagoditev razlike med epruvetami PCR in epruvetami, ki jih povzročajo napake pri odmerjanju PCR.Koncentracija 20 × ROX Reference Dye, ki je potrebna za različne instrumente, je različna in uporabnik jo lahko doda glede na priporočeno koncentracijo instrumenta.

ddH brez RNaze₂O: Sterilizirana ultra čista voda brez RNaze za dvostopenjske reakcije RT-qPCR.

Previdnostni ukrepi:(Pred uporabo kompleta natančno preberite previdnostne ukrepe)

Bodite pozorni na metodo izvajanja poskusa, da preprečite navzkrižno kontaminacijo med vzorci.

Bodite pozorni na čistočo eksperimentalnega okolja in pripomočkov, da preprečite kontaminacijo z RNazo in razgradnjo RNK.

Vzemite sveže ali dobro ohranjene vzorce celic in nikoli ne uporabite ponavljajočih se zamrznjenih in odmrznjenih vzorcev celic.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman se mora izogibati ponavljajočemu se zamrzovanju-odmrzovanju, sicer bo to vplivalo na obratno prepisovanje in učinkovitost PCR.

Pripravaobrokeprejdelovanje

Pred uporabo tega kompleta natančno preberite navodila.Komplet Cell Direct RT-qPCR je preprost, priročen in hiter za uporabo, navodila pa nudijo popolne informacije o celotnem kompletu in o pravilni uporabi.Pred uporabo pripravite potrebne eksperimentalne materiale in opremo.

Eksperimentalni materiali in oprema

◆ Kultura celic.

◆ 1,5 ml ali 2 ml, centrifugalna epruveta brez RNaze/DNaze, konica brez RNaze/DNaze, 0,2 ml sterilna epruveta qPCR.

◆ naprava za qPCR, pipeta, namizna centrifuga (≥13.400×g) (odvisno od eksperimentalnih potreb) itd.

Varnost

◆ Ta izdelek je samo za znanstvenoraziskovalne namene, prosimo, ne uporabljajte ga v farmacevtske, klinične, prehrambene in kozmetične namene.

◆ Pri uporabi kemikalij nosite primerna laboratorijska oblačila, rokavice, zaščitna očala itd.

Delovanjevodniki

Sisteme za lizo celic, sisteme RT in dodatne pakete reakcijske raztopine qPCR je mogoče kupiti ločeno, za podrobnosti v Dodatku 1 (STRAN 13).

Navodila za uporabo

O: Sproščanje vzorca RNA

1. Celice so bile predhodno obdelane: ploščo s celično kulturo sperite s hladnim PBS, nato celice lizirajte (10-10⁶), 10⁶ kot število celic, priporočamo Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) ali Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) za ekstrakcijo in čiščenje RNA.

1.1.Adherentne celice (na primer plošča s 24 jamicami)

1.1.1.Določite število celic v vsaki vdolbinici, ugotovite, da je število celic 1 × 10⁵, in s pipeto odstranite gojišče iz posode s kulturo.

1.1.2.V vsako jamico dodajte 200 μl predhodno ohlajenega 1 × PBS.Ne pipetirajte večkrat in odstranite PBS iz vdolbinic.Nagnite ploščo in odstranite čim več PBS.Nadaljujte na 2. korak.

1.1.3.Različna posoda za celično kulturo ali referenčna številka tabele 1-1 v posodi za celično kulturo je bila dodana predhodno ohlajena 1 × PBS za izpiranje celic.

Tabela 1-1: Odmerjanje PBS za različno število celic

Opomba:Za zagotovitev trdnih adhezivnih celic，pri pranju preprečimo izgubo velikega števila celic.

1.2.Suspenzijske celice ali adherentne celice, gojene v neporoznih ploščah

1.2.1.Adherentne celice, gojene v ploščah brez več vdolbinic (suspenzijske celice se začnejo z naslednjim korakom 1.2.2), zberejo in ločijo celice v skladu z običajno metodo zbiranja celic in jih postavijo v ploščo za kulturo ali centrifugalno epruveto;če se uporabi tripsinizacija, je potrebno centrifugiranje za zbiranje celic in odstranitev preostalega tripsina, dodane PBS resuspendirane celice v posamezne celice, da se celice razpršijo.

1.2.2.Po preštetem številu celic alikvote celic 1×10⁵ enega v epruvete za centrifugiranje, celice zberemo s centrifugiranjem pri 1000 × g 10 minut.

1.2.3.Dodajte 200 μl PBS v epruveto za centrifugo, ne pipetirajte večkrat in neposredno aspirirajte PBS.nadaljujte s korakom 2. (Če je težko obarjanje in so bile celice ponovno resuspendirane, se lahko izvede 1000 × g centrifugiranje 10 minut po zavrženju supernatanta, celični pelet nadaljujte s korakom 2)

2. Celična liza: Odstranite pufer CL, njegovo temperaturo uravnotežite s sobno temperaturo, DNA Eraser in Foregene Protease Plus II, v skladu z naslednjo tabelo 1-2 pripravljen sistem za lizo: (raztopina za lizo je pripravljena za uporabo).

Tabela 1-2: cepitev priprava sistema (Opomba: pri pripravi na ledu)

3. (Plošča s 24 vdolbinicami kot primer) Odpipetirajte 200 μl glavne mešanice za lizo celic v vsako vdolbinico, večkrat pihajte 5-10-krat, inkubirajte pri sobni temperaturi (20-25 ℃) 5 minut.

Opomba:Da bi se izognili nastajanju mehurčkov, prosimo, da pri pipetiranju nastavite merilo pipete na 200 μl ali manj.Celice so po lizi lahko videti motne, kar je normalno.

4. (Plošča s 24 vdolbinicami kot primer) dodamo v tekočino 20 μl pufra ST (različni lizni sistemi pufer ST dodamo v količini, prikazani v tabeli 1-3), ponovimo pipetiranje 5-10-krat, pri sobni temperaturi (20-25 ℃) inkubiramo 2 minuti.

Opomba:Konica pipete je nameščena pod površino, kar zagotavlja, da je bil dodan lizat，da preprečite nastajanje mehurčkov, prosimo, da pri pipetiranju merilo pipete nastavite na 200 μl ali manj.

Tabela 1-3:Dodajte medpomnilnik ST

5. Lizat se uporabi za nadaljnje poskuse RT-qPCR.Če nadaljnjih poskusov ni mogoče izvesti pravočasno, ga hranite na ledu največ 2 uri in shranite pri -20 ℃ ali -80 ℃ (ne več kot tri mesece).

B: Priprava sistema RT

1. Vzemite mešanico 5 × Direct RT in jo postavite na ledeno kopel, pustite, da se naravno stopi, in jo nežno premešajte za poznejšo uporabo;vzemite ddH2O brez RNaze in ga stopite ter postavite na ledeno kopel za kasnejšo uporabo.Pripravite reakcijski sistem na ledu v skladu s tabelo 2-1 spodaj.

Tabela 2-1: Priprava reakcijskega sistema RT

2. Po končani formulaciji sistema nežno premešajte in na kratko centrifugirajte v naslednji tabeli 2 -2 reakcijskih pogojev RT reakcija.

Tabela 2-2: Nastavitev pogojev reakcije RT

3. Po končani reakciji je bil reakcijski produkt postavljen neposredno na led za qPCR, prosimo, dajte za dolgoročno shranjevanje -20 ℃ ali -80 ℃.

Opomba: zaradi uporabe neprečiščene predloge se lahko v produktu reverzne transkripcije pojavijo bele oborine.To je normalen pojav.Takoj centrifugirajte supernatant za nadaljnje poskuse.

Nastala reakcijska raztopina RT se doda naslednjim korakom reakcijskih sistemov PCR v realnem času, priporočljivo je dodati količine v razponu od 10 do 30 % reakcijskega sistema.

C: Priprava reakcijskega sistema qPCR

1. Ustrezna količina B, pripravljena v šabloni cDNA koraka v skladu z naslednjo tabelo 3-1, za pripravo reakcijskega sistema.

Opomba: Količina predloge cDNA predstavlja 10–30 % sistema qPCR.Na primer, v 20 μl sistemu qPCR dodajte 2-6 μl liznega pufra, vendar ne več kot 6 μl.

2. Optimizacija dobrih pogojev qPCR (temperatura žarjenja, itd.) za reakcijo qPCR (pogoji reakcije, podani v tabeli 3-2).

Opomba: Poskusite uporabiti optimizirane pogoje za reakcije qPCR, da dobite boljše rezultate.

Tabela 3-1: Priprava reakcijskega sistema PCR

1*: Koncentracijo primerja je mogoče prilagoditi v območju 50–900 nM, če je reakcija primerja slaba.

Opomba: sistem qPCR je mogoče prilagoditi glede na eksperimentalne potrebe in model fluorescenčnega ciklerja.Za qPCR v 50μl sistem, sorazmerno prilagodite odmerek reagenta glede na 20μl sistem.

2*: Izberite ustrezno končno koncentracijo referenčnega barvila ROX v skladu s kvantitativnim termičnim ciklerjem fluorescence.Najprimernejše koncentracije referenčnega barvila ROX za običajne kvantitativne ciklerje fluorescence so prikazane v spodnji tabeli:

Tabela 3-2: Podani so pogoji reakcije qPCR

Opomba: Da bi dosegli najboljši učinek qPCR, lahko uporabite gradientno PCR za optimizacijo reakcijskih pogojev za različne predloge in različne primerje.Pogoji reakcije PCR se razlikujejo glede na analizator fluorescence, šablono, primer itd. Pri specifični operaciji je treba oblikovati optimalne reakcijske pogoje glede na posebne pogoje fluorescenčnega kvantitativnega termičnega ciklerja, vrsto predloge, velikost zanimivega fragmenta, bazno zaporedje pomnoženega fragmenta in vsebnost GC ter dolžino primerjev, vključno s temperaturo žarjenja, reakcijskim časom itd.

Načela zasnove primerja PCR v realnem času

Forward Primer in Reverse Primer

Za PCR v realnem času je zasnova primerja zelo pomembna.Primerji so povezani s specifičnostjo in učinkovitostjo pomnoževanja PCR in jih je mogoče oblikovati ob upoštevanju naslednjih načel:

◆ Dolžina primerja: 18-30bp.

◆ GC vsebnost: 40-60 %.

◆ Vrednost Tm: programska oprema za načrtovanje primerja, kot je Primer 5, lahko poda vrednost Tm primerja.Vrednosti Tm zgornjih in spodnjih primerjev morajo biti čim bližje.Uporabite lahko tudi formulo za izračun Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Pri izvajanju PCR je kot temperatura žarjenja običajno izbrana temperatura pod vrednostjo Tm primerja 5 °C (ustrezno zvišanje temperature žarjenja lahko poveča specifičnost reakcije PCR).

◆ Primerji in produkti PCR:

◆ Dolžina produkta PCR pomnoževanja primerja načrta je po možnosti 100-150 bp.

◆ Kolikor je mogoče, se je treba izogibati temeljnim premazom za oblikovanje v sekundarnem strukturnem območju šablone.

◆ Izogibajte se nastanku 2 ali več komplementarnih baz med 3' konci gorvodnega in spodnjega primerja.

◆ Primer 3' končna osnova ne more biti prisotna s 3 dodatnimi zaporednimi G ali C.

◆ Primerji sami ne morejo imeti komplementarnih struktur, sicer se bo oblikovala lasna struktura, ki vpliva na pomnoževanje PCR.

◆ ATCG je treba porazdeliti čim bolj enakomerno v zaporedju primerja, 3' terminalni bazi pa se je treba izogibati, saj T.

Dodatek1:Cell DirectRT-qPCR Sestavni del kompletat dopolnilni paket

1. Raztopina za lizo celic