Dobro je znano, da je v osrednji dogmi RNA transkripcijski posrednik med ekspresijo DNA in beljakovin.V primerjavi z detekcijo DNK lahko detekcija RNK bolj objektivno odraža izražanje genov v organizmih.Poskusi, ki vključujejo RNK, vključujejo: qRT-PCR, RNA-Seq in detekcijo fuzijskega gena itd. Na podlagi značilnosti same RNK (sladkorni obroč RNK ima eno prosto hidroksilno skupino več kot sladkorni obroč DNK), skupaj z velikim številom RNaz v okolju, je RNK bolj nestabilna in jo je lažje razgraditi kot DNK.Garbage noter, garbage out, če kakovost RNA ni dobra, potem morajo biti eksperimentalni rezultati nezadovoljivi, posebej izraženi kot netočni podatki ali slaba ponovljivost.Zato je treba več pozornosti nameniti obdelavi RNK, pomembnejša pa je tudi povezava s kontrolo kakovosti za zagotavljanje natančnosti in točnosti kasnejših eksperimentalnih podatkov.

Za nadzor kakovosti RNA se običajno uporabljajo naslednje metode:

• Spektrofotometrija
• elektroforeza v agaroznem gelu
• Bioanalizator Agilent
• fluorescenčna kvantitativna PCR v realnem času
• Metoda fluorescentnega barvila Qubit

01 Spektrofotometrija

RNA ima konjugirane dvojne vezi in ima absorpcijski vrh pri valovni dolžini 260 nm.V skladu z Lambert-Beerovim zakonom lahko izračunamo koncentracijo RNA iz absorpcijskega vrha pri 260 nm.Poleg tega lahko izračunamo tudi čistost RNA glede na razmerje absorpcijskih vrhov 260 nm, 280 nm in 230 nm.280 nm in 230 nm so absorpcijski vrhovi beljakovin oziroma majhnih molekul.Razmerje A260/A280 in A260/A230 kvalificirane čistosti RNA mora biti večje od 2. Če je manjše od 2, pomeni, da je v vzorcu RNA beljakovina ali kontaminacija z majhnimi molekulami in ga je treba ponovno prečistiti.Viri kontaminacije bodo vplivali na nadaljnje poskuse, kot je zaviranje učinkovitosti pomnoževanja reakcij PCR, kar bo povzročilo netočne kvantitativne rezultate.Čistost RNK ima velik vpliv na kasnejše rezultate, zato je spektrofotometrija praviloma nepogrešljiv člen kontrole kakovosti v prvem koraku pri poskusih nukleinskih kislin.

Slika 1. Tipičen absorpcijski spekter RNA/DNA

02 Elektroforeza v agaroznem gelu

Poleg čistosti je tudi integriteta RNK eden od pomembnih kazalnikov za presojo kakovosti RNK.Razgradnja RNA bo privedla do velikega števila kratkih fragmentov v vzorcu, zato bo število fragmentov RNA, ki jih je mogoče učinkovito zaznati in pokriti z referenčnim zaporedjem, zmanjšano.Celovitost RNA lahko preverimo z elektroforezo celotne RNA na 1 % agaroznem gelu.S to metodo lahko sami konfigurirate gel ali uporabite vnaprej izdelan sistem E-Gel™ za testiranje celovitosti.Več kot 80 % celotne RNA je ribosomska RNA, ki je večinoma sestavljena iz 28S in 18S rRNA (v sistemih sesalcev).Kakovostna RNA bo pokazala dve očitni svetli črti, ki sta svetli črti 28S oziroma 18S, pri 5 Kb in 2 Kb, razmerje pa bo skoraj 2:1.Če je v difuznem stanju, to pomeni, da je bil vzorec RNA morda razgrajen, zato je priporočljivo uporabiti metodo, opisano v nadaljevanju, za nadaljnje testiranje kakovosti RNA.

Slika 2. Primerjava razgrajene (proga 2) in nepoškodovane RNA (proga 3) pri elektroforezi v agaroznem gelu

03 Bioanalizator Agilent

Poleg zgoraj opisane metode elektroforeze v agaroznem gelu, s katero lahko enostavno in hitro ugotovimo celovitost RNK, lahko za ugotavljanje integritete RNK uporabimo tudi bioanalizator Agilent.Za oceno koncentracije in celovitosti RNK uporablja kombinacijo mikrofluidike, kapilarne elektroforeze in fluorescence.Z uporabo vgrajenega algoritma za analizo profila vzorca RNA lahko bioanalizator Agilent izračuna referenčno vrednost integritete RNA, RNA Integrity Number (v nadaljevanju RIN) [1].Večja kot je vrednost RIN, večja je celovitost RNA (1 je zelo razgrajena, 10 je najbolj popolna).Nekateri poskusi, ki vključujejo RNA, predlagajo uporabo RIN kot parametra za oceno kakovosti.Če vzamemo za primer visoko zmogljive poskuse sekvenciranja (v nadaljevanju NGS), smernice Oncomine™ Human Immune Repertoire, ki se uporablja za odkrivanje receptorjev antigenov celic B in T v seriji panelov Oncomine podjetja Thermo Fisher, kažejo, da je mogoče izmeriti vzorce z vrednostmi RIN, večjimi od 4, učinkovitejše odčitke in klone (slika 3).Obstajajo različni priporočeni razponi za različne plošče in pogosto lahko višji RIN prinese učinkovitejše podatke.

Na sliki 3 lahko v poskusih Oncomine™ Human Immune Repertoire vzorci z RIN večjim od 4 zaznajo učinkovitejše odčitke in T-celične klone.【2】

Vendar ima vrednost RIN tudi nekaj omejitev.Čeprav ima RIN visoko korelacijo s kakovostjo eksperimentalnih podatkov NGS, ni primeren za vzorce FFPE.Vzorci FFPE so bili dolgo časa kemično obdelani in ekstrahirana RNA ima na splošno razmeroma nizko vrednost RIN.Vendar to ne pomeni, da morajo biti učinkoviti podatki poskusa nezadovoljivi.Za natančno oceno kakovosti vzorcev FFPE moramo uporabiti meritve, ki niso RIN.Poleg RIN lahko bioanalizator Agilent izračuna tudi vrednost DV200 kot evalvacijski parameter kakovosti RNA.DV200 je parameter, ki izračuna delež fragmentov, večjih od 200 bp, v vzorcu RNA.DV200 je boljši pokazatelj kakovosti vzorca FFPE kot RIN.Za RNA, ekstrahirano s FFPE, je zelo visoka korelacija s številom genov, ki jih je mogoče učinkovito zaznati, in raznolikostjo genov [3].Čeprav lahko DV200 nadomesti pomanjkljivosti pri odkrivanju kakovosti FFPE, bioanalizator Agilent še vedno ne more celovito analizirati težav s kakovostjo v vzorcih RNK, vključno s tem, ali so v vzorcih inhibitorji.Inhibitorji sami lahko vplivajo na učinkovitost pomnoževanja nadaljnjih poskusov in zmanjšajo količino uporabnih podatkov.Da bi vedeli, ali je v vzorcu inhibitor, lahko uporabimo metodo fluorescentne kvantitativne PCR v realnem času, ki je opisana v nadaljevanju.

04 fluorescenčna kvantitativna PCR v realnem času

Metoda fluorescentne kvantitativne PCR v realnem času ne more samo zaznati inhibitorjev v vzorcu, ampak tudi natančno odraža kakovost RNA v vzorcu FFPE.V primerjavi z biološkimi analizatorji Agilent so kvantitativni instrumenti za fluorescenco v realnem času bolj priljubljeni v večjih bioloških laboratorijih zaradi svoje širše uporabe.Za testiranje kakovosti vzorcev RNA moramo le kupiti ali pripraviti primer sonde za notranje referenčne gene, kot je GUSB (kat. št. Hs00939627).Z uporabo tega nabora primerjev, sond in standardov (celotna RNA znane koncentracije) za izvedbo absolutnih kvantitativnih poskusov je mogoče izračunati efektivno koncentracijo fragmenta RNA kot standard vrednotenja kakovosti RNA (na kratko funkcionalna kvantitacija RNA (FRQ)).V testu NGS smo ugotovili, da ima FRQ vzorcev RNA zelo visoko korelacijo z efektivno količino podatkov.Za vse vzorce, ki so večji od 0,2 ng/uL FRQ, lahko vsaj 70 % odčitkov učinkovito pokrije referenčno zaporedje (slika 4).

Na sliki 4 je vrednost FRQ, zaznana s kvantitativno metodo fluorescence, v zelo visoki korelaciji (R2>0,9) z učinkovitimi podatki, pridobljenimi v poskusu NGS.Rdeča črta je vrednost FRQ, ki je enaka 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Poleg tega, da je uporabna za vzorce FFPE, lahko metoda kvantitativne PCR v realnem času tudi učinkovito spremlja inhibitorje v vzorcih.Vzorec, ki ga je treba zaznati, lahko dodamo v reakcijski sistem z notranjo pozitivno kontrolo (IPC) in njegovo analizo ter nato izvedemo kvantifikacijo fluorescence, da dobimo vrednost Ct.Če vrednost Ct zaostaja za vrednostjo Ct v reakciji brez vzorca, to pomeni, da je inhibitor prisoten v vzorcu in zavira učinkovitost pomnoževanja v reakciji.

05 Metoda fluorescentnega barvila Qubit

Qubit Fluorometer je najpogosteje uporabljena majhna naprava za določanje koncentracije in čistosti nukleinske kisline, ki je enostavna za uporabo in obstaja v skoraj vsakem laboratoriju za molekularno biologijo.Natančno izračuna koncentracijo nukleinske kisline z detekcijo in fluorescenčnim barvilom, ki veže nukleinsko kislino (Qubit detekcijski reagent).Qubit ima visoko občutljivost in specifičnost ter lahko natančno kvantificira RNA do koncentracije pg/µL.Poleg dobro znane zmožnosti natančnega kvantificiranja koncentracije nukleinske kisline lahko najnovejši nov model Thermo Fisherjev, Qubit 4.0, zazna tudi celovitost RNK.Sistem Qubit 4.0 za zaznavanje RNA (RNA IQ Assay) zazna celovitost RNA s hkratnim zaznavanjem dveh specifičnih fluorescenčnih barvil.Ti dve fluorescentni barvili se lahko vežeta na velike in majhne fragmente RNA.Ti dve fluorescenčni barvili označujeta delež velikih fragmentov RNA v vzorcu, iz tega pa je mogoče izračunati vrednost IQ (Integrity and Quality), ki predstavlja kakovost RNA.Vrednost IQ je uporabna za vzorce FFPE in vzorce brez FFPE in ima velik vpliv na kasnejšo kakovost zaporedja.Če za primer vzamemo eksperimente NGS, je v testnih poskusih RNA-Seq, izvedenih na platformi Ion torrent™, večina vzorcev z vrednostmi IQ nad 4 imela vsaj 50 % učinkovitih odčitkov (slika 5).V primerjavi z zgoraj omenjenimi metodami odkrivanja Qubit IQ Assay ni le bolj priročen za uporabo in traja manj časa (v petih minutah), ampak ima tudi veliko korelacijo med izmerjeno vrednostjo parametra IQ in kakovostjo podatkov nadaljnjih poskusov.

Na sliki 5 obstaja velika korelacija med vrednostjo Qubit RNA IQ in preslikanimi odčitki RNA-Seq.【5】

Z zgornjim uvodom menim, da vsi dovolj razumejo različne metode nadzora kakovosti RNA.V praksi lahko izbirateustrezno metodo glede na vrsto vzorca in obstoječe instrumente.Samo z dobrim nadzorom kakovosti RNA se lahko izognemo neuspehu kasnejših poskusov, ki jih povzroči slaba kakovost vzorca, in tako prihranimo dragocen čas, energijo in stroške.

Referenčni izdelki:

Komplet za izolacijo celotne živalske RNA

Cell Total RNA Isolation Kit

reference

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: številka integritete RNA za dodeljevanje vrednosti integritete meritvam RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Uporabniški priročnik Oncomine Human Immune Repertoire (Pub. št. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, zvezek 170, številka 2, avgust 2019, strani 357 –373,https://doi.org/10.1093/toxsci/