Komplet za odkrivanje nukleinske kisline Escherichia coli O157:H7 (metoda s fluorescenčno sondo PCR)
Opis kompleta:
kat.št.FP102
Uporablja se za hitro odkrivanje in presejanje E. coli O157:H7 v vzorcih hrane, krme, vode in okolja.
Opisi
Uporablja se za hitro odkrivanje in presejanje E. coli O157:H7 v vzorcih hrane, krme, vode in okolja.
[Načelo testiranja]V skladu z načelom tehnologije fluorescentne PCR so specifični primerji in Taqmanove sonde oblikovani za specifičen gen Escherichia coli O157: H7 in jih odkrije fluorescentni PCR instrument, tako da se izvede detekcija Escherichia coli O157: H7 Kvalitativno odkrivanje DNK.
Vsebina kompleta
Opomba: Kanalna sonda ROX ni priložena.
| Ckomponente | Specifikacija | Quantity |
| Medpomnilnik A | Cev | 1 |
| Medpomnilnik B | Cev | 1 |
| Pozitivna kontrola | Cev | 1 |
| Negativna kontrola | Cev | 1 |
Pričakovana uporaba
Uporablja se za hitro odkrivanje in presejanje E. coli O157:H7 v vzorcih hrane, krme, vode in okolja.
Pogoji shranjevanja in rok uporabe
Shranjujte pri -20 ℃ v temi in se izogibajte ponovnemu zamrzovanju in odmrzovanju.
Rok veljavnosti je 12mesecev, datum proizvodnje pa je naveden na zunanji embalaži.
Instrumenti in potrošni material
Fluorescentni kvantitativni PCR instrument, pipetna pištola in ustrezne konice, vrtinčni stresalnik, mini centrifuga.
Uporaba
1. Obdelava vzorcev
1.1 Vrsta vzorca: Ta komplet je primeren za vzorce hrane, krme, vode in druge vzorce, za katere obstaja sum, da so kontaminirani z Escherichia coli O157:H7.Za globoko predelane mesne izdelke, pijače in druge snovi, ki vsebujejo pigmente, jih je treba sprati, da ne bi vplivali na zbiranje fluorescenčnih signalov.
1.2 Obdelava vzorca: Za pripravo vzorca, obogatitveno kulturo in izolacijo bakterije Escherichia coli O157: H7 glejte "GB 4789.10-2016 nacionalni standard živilske mikrobiološke preiskave Escherichie coli O157: H7 test".
- Nekstrakcija ukleinske kisline
V 1,5-ml epruveto za centrifugo vzemite 20 ml obogatitvene raztopine, dodajte 200 μl mikrobnega lizata (potreben je dodaten komplet), vrtinčite 30 sekund, na kratko centrifugirajte in odstavite.
Opombe: Ekstrakcija nukleinske kisline iz lizata mora biti končana v 10 minutah in je ni mogoče shranjevati dlje časa.
3. Pomnoževanje nukleinske kisline
3.1 Vklopite fluorescentni kvantitativni PCR instrument za uporabo.
Pufer A in pufer B iz kompleta, ju temeljito stopite in na kratko centrifugirajte.V vsako reakcijsko epruveto PCR dodajte 18 μL pufra A in 2 μL pufra B.Nato dodajte po 5 ml negativne kontrole, ekstrahirane nukleinske kisline in pozitivne kontrole v reakcijske epruvete za PCR, zaprite epruvete in na kratko centrifugirajte.
3.3 Reakcijsko epruveto PCR prenesite v fluorescenčni stroj za PCR in uporabite naslednje postopke za izvedbo poskusov pomnoževanja: izberite 25 ml za reakcijski sistem, zberite fluorescenčne signale pri 60 °C za vsak cikel in izberite FAM za detekcijski kanal.
| korak | Program | Število ciklov |
| 1 | 37 ℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15 s | 4 0 |
| 60 ℃ 30 s (zbiranje fluorescence) |
Navodila za analizo problemov
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
RNK ni mogoče ekstrahirati ali pa je izkoristek nukleinske kisline nizek
Običajno obstaja veliko dejavnikov, ki vplivajo na učinkovitost predelave, kot so: vsebnost RNA vzorca, način delovanja, volumen elucije itd.
Analiza pogostih vzrokov:
1. Ledena kopel ali nizkotemperaturno (4 °C) centrifugiranje med delovanjem.
Predlog: Delovanje pri sobni temperaturi (15-25 °C), nikoli ledena kopel in nizkotemperaturna centrifuga.
2. Nepravilno shranjevanje vzorca ali predolgo shranjevanje vzorca.
Predlog: Vzorce hranite pri -80 °C ali zamrznite v tekočem dušiku in se izogibajte ponavljajoči se uporabi pri zamrzovanju in odmrzovanju;poskusite uporabiti sveže zbrane vzorce za ekstrakcijo RNA.
3. Nezadostna liza vzorca
Priporočilo: Prepričajte se, da sta vzorec in delovna raztopina (linearni akrilamid) temeljito premešana in inkubirana 10 minut pri sobni temperaturi (15-25 °C)
4.Eluent je bil dodan nepravilno
Priporočilo: Prepričajte se, da je ddH2O brez RNaze dodan na sredino membrane čistilne kolone
5. Neustrezna prostornina brezvodnega etanola v pufru viRW2
Predlog: Prosimo, sledite navodilom, dodajte pravo količino brezvodnega etanola v pufer viRW2 in dobro premešajte pred uporabo kompleta.
6. Nepravilna uporaba vzorca.
Predlog: 200 µl vzorca na 500 µl pufra viRL.Prevelika količina vzorca bo povzročila zmanjšano stopnjo ekstrakcije RNK.
7. Neustrezen volumen elucije ali nepopolna elucija.
Predlog: Volumen eluenta čistilne kolone je 30-50 μl;če učinek elucije ni zadovoljiv, je priporočljivo dodati predhodno segret ddH brez RNaze2O in podaljšajte čas postavitve na sobno temperaturo, na primer 5-10 minut
8. Čistilna kolona ima ostanek etanola po izpiranju v pufru viRW2.
Predlog: Če po izpiranju v pufru viRW2 in 2-minutnem centrifugiranju v prazni epruveti še vedno ostane etanol, lahko čistilno kolono po centrifugiranju v prazni epruveti pustite 5 minut pri sobni temperaturi, da v celoti odstranite preostali etanol.
Razgradnja prečiščenih molekul RNA
Kakovost prečiščene RNA je povezana z dejavniki, kot so shranjevanje vzorca, kontaminacija RNaze in delovanje.
Analiza pogostih vzrokov:
1. Zbrani vzorci niso bili pravočasno shranjeni.
Predlog: Če vzorca ne uporabite pravočasno po odvzemu, ga takoj shranite pri -80 ℃ ali na tekoči dušik.Za ekstrakcijo molekul RNA poskusite uporabiti sveže zbrane vzorce, kadar koli je to mogoče.
2. Zbrani vzorci so se večkrat zamrznili in odtajali.
Predlog: med zbiranjem in shranjevanjem vzorca se izogibajte ponavljajočemu se zamrzovanju in odmrzovanju (ne več kot enkrat), sicer se bo izkoristek nukleinske kisline zmanjšal.
3. RNaza je bila uvedena v operacijski sobi ali pa se niso uporabljale rokavice za enkratno uporabo, maske itd.
Predlog: Poskus ekstrakcije molekul RNK je najbolje izvesti v ločeni sobi za operacijo RNK, pred poskusom pa se poskusna miza očisti.Med poskusom nosite rokavice in maske za enkratno uporabo, da se izognete razgradnji RNK zaradi vnosa RNaze.
4. Reagent je med uporabo kontaminiran z RNazo.
Predlog: zamenjajte z novim kompletom za izolacijo virusne RNA za sorodne poskuse.
5. Kontaminacija centrifugalnih epruvet, konic pipet itd. z RNazo. Predlog: Prepričajte se, da so vse centrifugalne epruvete, konice pipet in pipete brez RNaze.
Očiščene molekule RNA so vplivale na nadaljnje poskuse
Molekule RNA, prečiščene s čistilno kolono, bodo vplivale na nadaljnje poskuse, če je preveč solnih ionov ali beljakovin, kot so: reverzna transkripcija, Northern Blot itd.
1. V eluiranih molekulah RNA so preostali ioni soli.
Priporočilo: Prepričajte se, da je bila pufru viRW2 dodana ustrezna količina brezvodnega etanola, in čistilno kolono dvakrat sperite v skladu s pravilno hitrostjo centrifugiranja v navodilih za uporabo；Če so še vedno preostali ioni soli, lahko v čistilno kolono dodate pufer viRW2 in jo pustite pri sobni temperaturi 5 minut.Nato izvedite centrifugiranje, da v največji meri odstranite kontaminacijo z ioni soli
2. V eluiranih molekulah RNA je preostali etanol
Predlog: ko potrdite, da so bile čistilne kolone izprane s pufrom viRW2, izvedite centrifugiranje s prazno epruveto v skladu s centrifugalno hitrostjo v navodilih za uporabo.Če še vedno ostane etanol, ga lahko po centrifugiranju v prazni epruveti pustite 5 minut pri sobni temperaturi, da v največji meri odstranite preostali etanol.
Navodila za uporabo:
Priročnik z navodili za komplet za izolacijo virusne RNA
