1. Začetno razumevanje

Na tej stopnji moramo razumeti nekatere pojme in terminologijo, da se izognemo napakam pred starejšimi, kot so:

V: Kakšna je razlika med RT-PCR, qPCR, PCR v realnem času in RT-PCR v realnem času?

Odgovor: RT-PCR je PCR z reverzno transkripcijo(reverse transcription PCR, RT-PCR), ki je zelo razširjena različica verižne reakcije s polimerazo (PCR).Pri RT-PCR se veriga RNA reverzno prepiše v komplementarno DNA, ki se nato uporabi kot predloga za pomnoževanje DNA s PCR.
PCR v realnem času in qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) sta enaka stvar, oba sta kvantitativna PCR v realnem času, kar pomeni, da ima vsak cikel PCR podatke v realnem času, tako da je mogoče število začetnih predlog prilagoditi natančni analizi.

Čeprav se zdi, da sta PCR v realnem času (fluorescentna kvantitativna PCR v realnem času) in PCR z reverzno transkripcijo (PCR z reverzno transkripcijo) skrajšani kot RT-PCR, je mednarodna konvencija: RT-PCR se posebej nanaša na reverzno transkripcijoPCR, PCR v realnem času je na splošno okrajšan kot qPCR (kvantitativni PCR v realnem času)..

In RT-PCR v realnem času (RT-qPCR), je PCR z reverzno transkripcijo v kombinaciji s fluorescentno kvantitativno tehnologijo: najprej pridobite cDNA (RT) iz reverzne transkripcije RNA in nato uporabite PCR v realnem času za kvantitativno analizo (qPCR).Večina laboratorijev izvaja RT-qPCR, to je raziskavo znižane regulacije izražanja RNA, tako da se qPCR, o katerem vsi govorijo v laboratoriju, dejansko nanaša na RT-qPCR, vendar ne pozabite, da je v kliničnih aplikacijah še vedno veliko DNK testov.Kvantitativna analiza, kot je odkrivanje HBV virusa hepatitisa B.

Vprašanje: Zakaj bi morali pomnoženi fragment nadzorovati v območju 80–300 bp, potem ko smo prebrali veliko fluorescenčnega kvantitativnega PCR?

Odgovori: Dolžina vsakega genskega zaporedja je drugačna, nekatere so več kb, nekatere na stotine bp, vendar moramo zahtevati le, da je dolžina produkta 80–300 bp pri načrtovanju primerjev, prekratki ali predolgi niso primerni za fluorescentno kvantitativno detekcijo PCR.Fragment izdelka je prekratek, da bi ga razlikovali od temeljnega dimera.Dolžina primer-dimera je približno 30-40 bp in težko je ločiti, ali je primer-dimer ali produkt, če je manjši od 80 bp.Če je fragment produkta predolg in presega 300 bp, bo zlahka povzročil nizko učinkovitost pomnoževanja in ne more učinkovito zaznati količine gena.

Na primer, ko štejete, koliko ljudi je v učilnici, morate prešteti le, koliko ust je.Enako velja, ko odkrivate gene, odkriti morate samo določeno zaporedje gena, ki predstavlja celotno zaporedje.Če hočeš šteti ljudi, moraš šteti usta in nosove, ušesa in očala, in zlahka se zmotiš.

Če povemo, v bioloških raziskavah obstaja veliko raziskovalnih primerov od točke do področja, ker je gensko zaporedje katere koli vrste zelo dolgo, je nepotrebno in nemogoče izmeriti vse fragmente, kot je bakterijsko sekvenciranje 16S, kar pomeni izvedbo konzervativnega zaporedja bakterijskih testov za sklepanje o številu določene populacije bakterij.

V: Kakšna je optimalna dolžina za zasnovo primerja qPCR?

Odgovori: Na splošno je dolžina primerja približno 20–24 bp, kar je boljše.Seveda pa moramo biti pri načrtovanju temeljnega premaza pozorni na vrednost TM temeljnega premaza, ker je ta povezana z optimalno temperaturo žarjenja.Po številnih poskusih je bilo dokazano, da je 60°C boljša vrednost TM.Če je temperatura žarjenja prenizka, bo zlahka povzročila nespecifično ojačanje.Če je temperatura žarjenja previsoka, bo učinkovitost ojačanja relativno nizka, vrh krivulje ojačanja se bo začel pozneje in vrednost CT bo zakasnjena.

V: Kako se metoda barvanja razlikuje od metode sonde?

Odgovor: Metoda barvanjaNekatera fluorescentna barvila, kot so SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO itd., sama po sebi ne oddajajo svetlobe, ampak bodo oddajala fluorescenco po vezavi na manjši utor dvoverižne DNA.Zato naprava na začetku reakcije PCR ne more zaznati fluorescentnega signala.Ko reakcija doseže stopnjo žarjenja-podaljšanja, se dvojna veriga odpre in pod delovanjem DNA polimeraze se sintetizira nova veriga, fluorescentna molekula pa se veže na manjši utor dsDNA.Ko se število ciklov PCR povečuje, se vse več barvil kombinira z dvoverižno DNA, fluorescentni signal pa se nenehno krepi.Metoda barvanja se uporablja predvsem v znanstvenih raziskavah.
PS: Bodite previdni, ko izvajate poskus, barvilo mora biti kombinirano s človeško DNK, pazite, da ga spremenite v fluorescentno osebo.

Metoda barvanja (levo) Metoda sonde (desno)
PS: Bodite previdni, ko izvajate poskus, barvilo mora biti kombinirano s človeško DNK, pazite, da ga spremenite v fluorescentno osebo.

SYBR Green Ⅰ se veže na manjši utor DNK

Metoda sondeTaqmanova sonda je najpogosteje uporabljena hidrolizna sonda.Na 5' koncu sonde je fluorescenčna skupina, običajno FAM, sama sonda pa je zaporedje, ki je komplementarno ciljnemu genu.Na 3′ koncu je fluorescenčna skupina za dušenje.V skladu z načelom fluorescenčnega resonančnega prenosa energije (Försterjev resonančni prenos energije, FRET), ko sta reporterska fluorescenčna skupina (donorska fluorescentna molekula) in dušilna fluorescenčna skupina (akceptorska fluorescentna molekula) vzbujeni, ko se spektra prekrivata in je razdalja zelo blizu (7–10 nm), lahko vzbujanje donorske molekule inducira fluorescenco akceptorske molekule, medtem ko je avtofluorescenca oslabljena.Zato na začetku reakcije PCR, ko je sonda prosta in nedotaknjena v sistemu, reporterska fluorescentna skupina ne bo oddajala fluorescence.Pri žarjenju se temeljni premaz in sonda vežeta na šablono.V fazi podaljšanja polimeraza nenehno sintetizira nove verige.DNA polimeraza ima 5'-3' eksonukleazno aktivnost.Ko doseže sondo, DNA polimeraza hidrolizira sondo iz matrice, loči reportersko fluorescenčno skupino od dušilne fluorescenčne skupine in sprosti fluorescentni signal.Ker obstaja med sondo in šablono razmerje ena proti ena, je metoda sonde boljša od metode barvanja v smislu natančnosti in občutljivosti testa.V diagnostiki se uporablja predvsem metoda sonde.

V: Kaj je absolutna kvantifikacija?Kaj je relativna kvantifikacija?

Odgovori: Absolutna kvantifikacija se nanaša na izračun začetnega števila kopij vzorca, ki ga je treba testirati s qPCR, na primer, koliko virusov HBV je v 1 ml krvi.Rezultat, dobljen z relativno kvantifikacijo, je sprememba količine ciljnega gena v določenem vzorcu glede na drug referenčni vzorec, izražanje gena pa je regulirano navzgor ali navzdol.

V: Ali bodo količina ekstrakcije RNK, učinkovitost reverzne transkripcije in učinkovitost pomnoževanja vplivali na eksperimentalne rezultate?
V: Ali bodo shranjevanje vzorca, ekstrakcijski reagenti, reagenti za reverzno transkripcijo in potrošni material, ki prepušča svetlobo, vplivali na eksperimentalne rezultate?
V: Katera metoda lahko popravi eksperimentalne podatke?

V zvezi s temi vprašanji jih bomo podrobno opisali v naprednih in naprednih razdelkih spodaj.
2. Napredno znanje

Kar zadeva fluorescentno kvantitativno PCR v realnem času, se moramo zavedati dejstva, da je vsako leto objavljenih na tisoče znanstvenih raziskovalnih člankov, med katerimi ni malo tehnologije fluorescentne kvantitativne PCR.

Če ni skupnega standarda za merjenje fluorescenčnega kvantitativnega poskusa PCR, se lahko rezultati zelo razlikujejo.Za isti gen iste vrste, z isto metodo obdelave, bodo tudi rezultati detekcije zelo različni in zamudniki bodo težko ponovili iste rezultate.Nihče ne ve, kaj je prav in kaj narobe.

Ali to pomeni, da je fluorescenčna kvantitativna PCR tehnologija goljufanja ali nezanesljiva tehnologija?Ne, to je zato, ker je fluorescentni kvantitativni PCR občutljivejši in natančnejši, malo napačna operacija pa bo povzročila povsem nasprotne rezultate.Majhna izguba je tisoč milj stran.Avtorja članka lahko recenzenti večkrat mučijo.Hkrati pa tudi recenzenti revije težko izbirajo med različnimi eksperimentalnimi rezultati.

Vse skupaj kaže na pomanjkanje soglasja v poskusih PCR v realnem času.V ta namen so višji znanstveniki v industriji začeli oblikovati standarde,od sodelavcev zahteva, da zagotovijo nekaj potrebnih eksperimentalnih podrobnosti in podrobnosti o obdelavi podatkov (vključno s potrebnimi podatki) v članku za izpolnjevanje teh standardov.

Ocenjevalci lahko ocenijo kakovost poskusa tako, da preberejo te podrobnosti;bodoči bralci lahko to uporabijo tudi za ponovitev poskusa ali izboljšanje poskusa.Potem so tako pridobljeni eksperimentalni rezultati polni informacij, kvalitetni in uporabni.

MIBBI (minimalne informacije za biološke in biomedicinske preiskave -http://www.mibbi.org) je nastal.MIBBI je projekt, ki zagotavlja standarde za eksperimente.Objavljeno je v naravi.Ta projekt je namenjen različnim biološkim poskusom, vključno s celično biologijo, mikromrežami, qPCR, o katerih bomo zdaj razpravljali, itd., in predvideva vsako vrsto poskusa ob oddaji rokopisov.Te informacije je treba zagotoviti ves čas.

V projektu MIBBI sta dva članka povezana s fluorescentno kvantitativno PCR, in sicer:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – strukturiran jezik in vodnik za poročanje za kvantitativne podatke PCR v realnem času;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimalne informacije za objavo člankov o kvantitativnih PCR poskusih v realnem času.
Najprej se pogovorimo o RDML, terminološki specifikaciji.

Če ni standardne definicije za vse, je nemogoče nadaljevati razpravo, zato je razlaga pojmov tako pomembna na izpitu.
Terminologija, uporabljena v poskusu fluorescentne kvantitativne PCR, vključuje naslednjo vsebino.QIAGEN je za nas naredil najboljši povzetek.Naslednji so vsi suhiblaga .

Krivulja ojačanja
Krivulja pomnoževanja se nanaša na krivuljo, izdelano med postopkom PCR, s številko cikla na abscisi in intenzivnostjo fluorescence v realnem času med reakcijo na ordinati.

Odlična ojačevalna krivulja mora imeti naslednje značilnosti: izhodiščna linija je ravna ali rahlo znižana in ni očitnega naraščajočega trenda;prevojna točka krivulje je jasna, naklon eksponentne faze pa je sorazmeren z učinkovitostjo ojačanja.Večji kot je naklon, večja je učinkovitost ojačanja;celotna ojačevalna krivulja Vzporednost je dobra, kar kaže, da je učinkovitost ojačenja vsake cevi podobna;eksponentna faza krivulje ojačanja vzorcev z nizko koncentracijo je očitna.

Izhodišče (izhodišče)
Izhodišče je raven hrupa v zgodnjem ciklu, ki se običajno meri med 3. in 15. ciklom, ker v tem obdobju ni mogoče zaznati povečanja vrednosti fluorescence, ki ga povzroči produkt pomnoževanja.Število ciklov, uporabljenih za izračun izhodišča, se lahko spreminja in ga bo morda treba zmanjšati, če se uporabljajo velike količine predloge ali če je raven izražanja ciljnega gena visoka.

Nastavitev osnovne črte zahteva ogled podatkov o fluorescenci iz krivulje linearnega ojačanja.Osnovna linija je nastavljena tako, da se rast krivulje ojačanja začne s številko cikla, ki je večja od zgornje številke osnovnega cikla.Osnovne vrednosti je treba nastaviti posebej za vsako ciljno zaporedje.Povprečne vrednosti fluorescence, zaznane v zgodnjih ciklih, je treba odšteti od vrednosti fluorescence, dobljenih v pomnoženih produktih.Najnovejše različice različnih programov za PCR v realnem času omogočajo samodejno optimizacijo osnovnih nastavitev za posamezne vzorce.

V prvih nekaj ciklih reakcije pomnoževanja PCR se fluorescenčni signal ne spremeni veliko.Približevanje ravni črti se imenuje osnovna črta, a če pozorno pogledamo prvih nekaj ciklov, vidimo, da je znotraj osnovne črte tisto, kar se dogaja na spodnji sliki.

Ozadje Ozadje se nanaša na
vrednost nespecifične fluorescence v reakciji.Na primer: neučinkovito dušenje fluorescence;ali veliko število dvoverižnih predlog DNK zaradi uporabe SYBR Green.Komponente ozadja signala matematično odstrani programski algoritem PCR v realnem času.

Reporterski signal
Reporterski signal se nanaša na fluorescentni signal, ki ga ustvari SYBR Green ali fluorescenčno označene sonde, specifične za zaporedje med PCR v realnem času.

Normaliziran poročevalski signal (RN)
RN se nanaša na intenziteto fluorescence reporterskega barvila, deljeno z intenzivnostjo fluorescence pasivnega referenčnega barvila, izmerjeno v vsakem ciklu.

Pasivno referenčno barvilo
Pri nekaterih PCR v realnem času,fluorescentno barvilo ROX se uporablja kot notranja referenca za normalizacijo fluorescentnega signala.Popravlja variacije zaradi netočnega pipetiranja, položaja vdolbinic in nihanj fluorescence od vdolbinice do vdolbinice.

Prag fluorescence (prag)
je bila prilagojena nad vrednostjo ozadja in znatno pod vrednostjo platoja krivulje ojačanja.Ležati mora v linearnem območju pomnoževalne krivulje, ki predstavlja log-linearni obseg detekcije PCR.Mejne vrednosti je treba nastaviti v pogledu krivulje logaritemskega pomnoževanja, tako da je logaritemsko linearna faza PCR zlahka prepoznavna.Če je v PCR v realnem času več ciljnih genov, je treba prag nastaviti za vsako tarčo.Na splošno se fluorescenčni signal prvih 15 ciklov reakcije PCR uporablja kot signal ozadja fluorescence, prag fluorescence pa je 10-kratnik standardnega odklona fluorescenčnega signala prvih 3 do 15 ciklov PCR, prag fluorescence pa je nastavljen v eksponentni fazi pomnoževanja PCR.Na splošno ima vsak instrument pred uporabo nastavljen svoj prag fluorescence.

Prag cikla (CT) ali prehodna točka (CP)
Cikel, pri katerem krivulja pomnoževanja preseže prag (tj. točka, pri kateri se zaznavanje fluorescence znatno poveča).CT je lahko delček in količino začetne predloge je mogoče izračunati.Vrednost CT predstavlja število ciklov, ko fluorescentni signal v vsaki reakcijski epruveti PCR doseže nastavljeni prag.Obstaja linearna povezava med vrednostjo CT vsake predloge in logaritmom začetne številke kopije predloge,višje je število začetnih kopij, manjša je vrednost CT in obratno.Standardno krivuljo lahko naredimo z uporabo standarda z znanim začetnim številom kopije, kjer abscisa predstavlja vrednost CT, ordinata pa logaritem začetnega števila kopij.Dokler je torej pridobljena vrednost CT neznanega vzorca, je mogoče začetno število kopij vzorca izračunati iz standardne krivulje.

ΔCT vrednost
ΔCT vrednost opisujerazlika med ciljnim genom in vrednostjo CT ustreznega endogenega referenčnega gena, kot je gospodinjski gen, in se uporablja za normalizacijo količine uporabljene predloge:
⇒ΔCT = CT (tarčni gen) – CT (endogeni referenčni gen)

ΔΔCT vrednost
Vrednost ΔΔCT opisuje razliko med srednjo vrednostjo ΔΔCT vzorca, ki nas zanima (npr. stimulirane celice) in srednjo vrednostjo ΔΔCT referenčnega vzorca (npr. nestimulirane celice).Referenčni vzorec se imenuje tudi umeritveni vzorec in vsi drugi vzorci se normalizirajo na to za relativno kvantifikacijo:
⇒ΔΔCT = povprečje ΔCT (vzorec, ki nas zanima) – povprečje ΔCT (referenčni vzorec)

Endogeni referenčni geni (endogeni referenčni geni)
Stopnje ekspresije endogenih referenčnih genov, kot so gospodinjski geni (gospodinjski geni), se med vzorci ne razlikujejo.Primerjava vrednosti CT referenčnega gena s ciljnim genom omogoča, da se raven izražanja ciljnega gena normalizira na količino vnesene RNA ali cDNA (glejte razdelek o vrednostih ΔCT zgoraj).

Notranji referenčni geni pravilni zamožno razgradnjo RNA ali prisotnost inhibitorjev encimov v vzorcih RNA, kot tudi variacije v vsebnosti RNA, učinkovitost reverzne transkripcije, obnovitev nukleinske kisline in ravnanje z vzorcem.Za izbiro optimalnih referenčnih genov smo spremenili algoritem, da bi omogočili izbiro optimalne reference, odvisno od eksperimentalne nastavitve.

Notranji nadzor
Kontrolno zaporedje, ki je pomnoženo v isti reakciji kot ciljno zaporedje in sondirano z drugo sondo (tj. izvajanje dupleksne PCR).Notranji nadzor se pogosto uporablja za izključitev neuspešnih pomnožev, na primer ko ciljno zaporedje ni zaznano.
Umeritveni vzorec
Referenčni vzorec (na primer prečiščena RNA iz celične linije ali tkiva), ki se uporablja pri relativni kvantifikaciji za primerjavo vseh drugih vzorcev za določitev relativne ravni izražanja gena.Umeritveni vzorec je lahko kateri koli vzorec, vendar je običajno kontrola (na primer neobdelan vzorec ali vzorec iz časa nič poskusa).

Pozitivne kontrole
uporabite nadzorne reakcije zznane količine predloge.Pozitivne kontrole se pogosto uporabljajo za preverjanje, ali komplet primerjev ali komplet primerjev–sonde deluje pravilno in ali je reakcija pravilno nastavljena.

Brez nadzora predlog (NTC)
Kontrolna reakcija, ki vsebuje vse potrebne komponente reakcije pomnoževanja razen šablone, ki se običajno nadomesti z vodo.Z uporabo NTC je mogoče najti kontaminacijo, ki jo povzroči kontaminacija z reagentom ali tuja DNK, s čimer se zagotovi pristnost in zanesljivost podatkov o detekciji.Povečanje kontrole NTC kaže na kontaminacijo.

Brez nadzora RT (NRT)
Postopek ekstrakcije RNK lahko vsebuje preostalo genomsko DNK, ki je izjemno škodljiva in je krivec za kakovost podatkov ter naravni sovražnik qPCR, zato mora biti pri načrtovanju poskusov zasnovan samo tako, da ojača detekcijo RNK.Obstajata dva načina, eden je oblikovanje primerjev čez introne, drugi je popolna odstranitev DNK, kateri je boljši, o čemer bomo razpravljali kasneje.Nadzor NTR je čarobno ogledalo za odkrivanje onesnaženja DNK.Če je ojačanje, pomeni, da je onesnaženje.

Standardi
Standardi so vzorci z znano koncentracijo ali številom kopij, ki se uporabljajo za izdelavo standardne krivulje.Da bi zagotovili stabilnost standarda, se genski fragment običajno klonira v plazmid in uporabi kot standard.

Standardna krivulja
običajno razredčimo v vsaj 5 koncentracijskih gradientov s standardnim produktom v skladu z razmerjem podvojitve, 5 točk pa se nariše v koordinate vrednosti CT in števila kopij, točke pa se povežejo v črto, da se ustvari standardna krivulja.Za vsako standardno krivuljo je treba preveriti njeno veljavnost.Vrednost naklona je med –3,3 in –3,8, vsaka koncentracija pa se izvede v trojniku.Točke, ki se bistveno razlikujejo od drugih točk, je treba zavreči.Vrednost CT vzorca, ki ga je treba testirati, se prenese v standardno krivuljo in lahko se izračuna raven izražanja vzorca, ki se testira.

Vrednost CT vzorca, ki ga je treba testirati, se prenese v standardno krivuljo in lahko se izračuna začetno število kopij vzorca, ki ga je treba testirati.

Učinkovitost in naklon
Naklon standardne krivulje predstavlja učinkovitost PCR v realnem času.
· Naklon -3,322 pomeni, da je učinkovitost pomnoževanja PCR 1 ali 100 % učinkovitost, količina produkta PCR pa se v vsakem ciklu podvoji.
· Naklon, manjši od –3,322 (npr. –3,8), pomeni učinkovitost PCR
· Naklon, večji od –3,322 (npr. –3,0), kaže, da je učinkovitost PCR večja od 100 %, kar je zanimivo, kako lahko en cikel PCR ustvari več kot dvojno količino pomnoženega produkta?Ta situacija se pojavi v nelinearni fazi reakcije PCR, kar pomeni, da obstaja velika količina nespecifičnega pomnoževanja.

krivulja taljenja
Po končanem pomnoževanju qPCR se produkt PCR segreje.Ko se temperatura dvigne, se dvoverižni pomnoževalni produkt postopoma stopi, kar povzroči zmanjšanje intenzivnosti fluorescence.Ko je dosežena določena temperatura (Tm), se stopi veliko število izdelkov.Fluorescenca močno upade.Različni produkti PCR imajo različne vrednosti Tm in različne temperature taljenja, tako da je mogoče prepoznati specifičnost PCR.

Krivulja taljenja (krivulja izpeljave)
Krivulja taljenja je izpeljana tako, da tvori zemljevid vrhov, ki lahko bolj intuitivno prikaže stanje fragmentov produkta PCR.Ker je temperatura taljenja vrednost Tm fragmenta DNA, je mogoče oceniti nekatere parametre, ki vplivajo na vrednost Tm fragmenta DNA, kot so velikost fragmenta, vsebnost GC itd.dolžina pomnoženega produkta je v območju 80-300 bp, zato mora biti temperatura taljenja med 80 °C in 90 °C.

Razlaga talilne krivulje: Če se edini glavni vrh pojavi med 80°C-90°C, to pomeni, da je fluorescenčna kvantitativna PCR popolna;če se glavni vrh pojavi med 80 °C-90 °C in se razni vrhovi pojavijo pod 80 °C, se v bistvu upošteva osnovni dimer.Lahko poskusite povečati temperaturo žarjenja, da jo rešite;če se glavni vrh pojavi med 80 °C-90 °C in se različni vrh pojavi znova, ko se temperatura dvigne, se v bistvu šteje, da je prišlo do kontaminacije DNK in je treba DNK odstraniti v začetni fazi poskusa.

Seveda je še vedno nekaj neobičajnih situacij, ki jih bomo v nadaljevanju obravnavali eno za drugo.
3. Napredno znanje

Da naredim qPCR, moram reči MIQE,Minimalne informacijeza objavoKvantitativnoPCR v realnem časuEksperimenti — minimalne informacije za objavo člankov o kvantitativnem PCR v realnem časuposkusi .Da bi vsem olajšali razumevanje, bomo poenostavili ključne vsebine.

Izvirno besedilo MIQE lahko poiščete na internetu, najpomembneje pa je, da določakontrolni seznam podatkov, ki jih je treba navesti ob objavi članka .

Ocenjevalci lahko ocenijo kakovost poskusa tako, da preberejo te podrobnosti;bodoči bralci lahko to uporabijo tudi za ponovitev ali izboljšanje poskusa.
Omeniti velja, da je na tem seznamu pomembnost vsakega seznama označena z E oziroma D.Kaj to pomeni?E: bistvene informacije (obvezno predložiti);D: zaželene informacije (navedite čim več).

MIQE (1)—Eksperimentalna zasnova
Marsikateri bedak, ki ima po končanem podiplomskem študiju zagovor, ne bo znal samostojno zasnovati eksperimenta, odpreti zvezka in narediti, kar mu učitelj naroči.Posledično eksperimentalna zasnova ni bila stroga in uredništvo revije je sporočilo, da so želeli izmisliti to in ono sliko, zato so to naredili v omami.Tako nastanejo bedaki!

Bližje domu je prvo načelo poskusa določitistrogost eksperimentalne logike.Najbolj temeljna stvar je zasnova eksperimenta, najpomembnejše pri zasnovi eksperimenta pa je, kako določiti ciljni vzorec, referenčni vzorec (kontrolo) in število ponovitev, da bodo lahko eksperimentalni podatki referenčni, primerljivi in ​​prepričljivi.

Ciljni vzorecse nanaša na vzorec, ki od nas zahteva odkrivanje ciljnega gena po določenem zdravljenju.Referenčni vzorecje vzorec brez obdelave, ki ga v biologiji pogosto imenujemo divji tip.

Eksperimentalne ponovitveso zelo pomembne.Na splošno mora biti število prepričljivih ponovitev večje od treh.Ločiti je treba, kaj je biološka replikacija in kaj tehnična replikacija.

Biološke ponovitve: Isti poskus preverjanja, izveden z različnimi materiali (čas, rastline, šarže, reakcijske plošče).

Biološko podvajanje
Vzemimo za primer obdelavo paprike s pesticidi.Želimo poškropiti pesticide na tri rastline ABC, potem so tri rastline ABC tri biološke ponovitve in gre za isti poskus preverjanja, izveden z različnimi materiali.Toda kot poskus je vsekakor potrebna kontrola, tako da lahko poškropimo eno od vej rastline A, da oblikujemo poskusno skupino rastline A, in ne škropimo drugih vej rastline A, da oblikujemo kontrolno skupino.Enako storite za B in C.

Tehnične kopije (tehnične kopije): Gre za ponavljajoči se poskus, namenjen izogibanju napakam, ki jih povzroči delovanje, ki je pravzaprav podvojena luknja v istem materialu.Tako zdravljenja kot kontrole morajo imeti nastavitve ponovitve (najmanj tri) ciljnega gena in notranjega referenčnega gena.

Tehnična ponovitev
Ponovno vzemimo za primer papriko, obdelano s pesticidi.Za eksperimentalno skupino rastline A smo naredili tri PCR luknje 1, 2 in 3 za njen ciljni gen oziroma interni referenčni gen, tako da smo po detekciji vzeli povprečje.Za zatiranje rastlin A skupine se prav tako obravnavajo na enak način.Podobno naredite enako obdelavo za rastline B in C.To je tehnično ponavljanje.

Omeniti velja, datisto, kar vstopi v statistiko, je biološka ponovitev, tehnična ponovitev pa je preverjanje, ali so v eksperimentalnem procesu kakšni naključni pojavi, da bi bili eksperimentalni rezultati verodostojni, se pravi, da bi se izognili napakam, tako da vzamemo njihovo povprečje, kot pogosto rečemo.

Negativne kontrole—NTC in NRT
NTC (nadzor brez predloge), kontrola brez šablone, se uporablja za preverjanje, ali je poskusni material kontaminiran.Na splošno se kot predloga uporablja voda.Če pride do fluorescentne reakcije, to pomeni, da je v laboratoriju prišlo do kontaminacije z nukleinsko kislino.

Ta onesnaženja izvirajo iz: nečiste vode, nekvalificiranih reagentov, ki vsebujejo endogeno DNK, onesnaženja s primerji, onesnaženja z laboratorijsko opremo, onesnaženja z aerosoli itd., potrebna je uporaba lovilcev RNaze in zaviralcev RNaze.Aerosolno onesnaženje je najtežje najti.Predstavljajte si, da je vaš laboratorij kot smog, z različnimi nukleinskimi kislinami, ki visijo v zraku.

NRT (brez reverzne transkriptaze), kontrola brez reverzne transkripcije, je nereverzno prepisana RNA kot negativna kontrola, ki je kontrola ostanka gDNA.

Pri izražanju genov se količina RNA odkrije z odkrivanjem količine cDNA po reverzni transkripciji.Če pri čiščenju RNA ostane ostanek gDNA, bo to povzročilo napake v eksperimentalnih rezultatih, ker sta dejanska dobljena rezultata gDNA in cDNA.Na agregatni ravni, ne samo cDNA, je treba med ekstrakcijo RNA popolnoma odstraniti gDNA.

MIQE (2)—vzorčne informacije
Tako imenovana vzorčna informacija pomeni, da moramo, ko objavimo članek o qPCR, jasno razložiti vzorčno informacijo, ki je nepogrešljiv del članka.Podobno moramo pri obdelavi vzorcev urediti tudi lastno delovanje, da zagotovimo veljavnost vzorcev.

Opis vzorca je le rezultat, zato moramo biti bolj pozorni na materiale, odvzete med celotnim poskusom.

Izbira eksperimentalnih materialov
Vzorci krvi – izberite svežo kri, največ 4 ure.Vzorci celic – odločite se za zbiranje svežih celic v obdobju močne rasti.Živalsko tkivo – izberite sveže, močno rastoče tkivo.Rastlinsko tkivo – izberite sveže, mlado tkivo.

Gotovo ste opazili, da je v teh nekaj stavkih ključna beseda: sveže .
Za zgornje vzorce je najboljši, stroškovno učinkovit in stabilen komplet na trgu Foregeneov komplet, s katerim lahko hitro in enostavno ekstrahirate njihovo DNK in RNK.

Mini komplet krvne DNK

Cell Total RNA Isolation Kit

Komplet za izolacijo celotne živalske RNA

Komplet za izolacijo celotne rastlinske RNK

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Komplet za izolacijo rastlinske DNK

Shranjevanje eksperimentalnih materialov
Na splošno ne priporočamo shranjevanja vzorcev, če razmere to dopuščajo.Vendar pa obstaja veliko prijateljev, ki ne morejo izvajati poskusov takoj po vzorčenju, nekateri pa morajo celo nositi rezervoarje s tekočim dušikom na polje za vzorčenje.

Za tako pridnega prijatelja lahko rečem le, da se ne razumeš na potrošni material za reagente.Zdaj mnoga podjetja za potrošni material reagentov proizvajajo reagente, ki lahko shranijo vzorce RNK pri sobni temperaturi, in lahko se odločite, da jih boste uporabili.Običajni način shranjevanja je shranjevanje tekočega dušika z uporabo majhnega rezervoarja za tekoči dušik, ki ga je enostavno prenašati.Ko vzorec prinesete nazaj v laboratorij, ga shranite v hladilniku pri -80 °C.

Pri poskusih, ki vključujejo RNA, je treba upoštevati načelo šestih besed:nizka temperatura, brez encimov,inhitro .

Koncept nizke temperature je lahko razumljiv;brez encimov je RNaza povsod po svetu, v katerem živimo (sicer bi vas ubil HIV), zato je zelo pomemben koncept, kako se izogniti RNazi pri izvajanju poskusov;hitro,Na svetu ni kung fuja, ki ga ni mogoče zlomiti, le hitrosti ni mogoče zlomiti.

Zato v nekem smislu krajši kot je čas ekstrakcije, boljši je komplet.ZakajForegenekiti poudarjajo hitrost, saj to dobro poznajo.

PS: Nekatera dekleta delajo eksperimente zelo previdno, vendar po več letih dela niso tako dobri kot zabijanje.Čutijo, da je Bog nepravičen, se pritožujejo nad drugimi in iščejo življenje.Pravzaprav tega ni razumela.RNK ni dobro zaščitil, igralec zabijanja pa je bil spreten.Ko je delal poskus, je mislil, da bo zabijanje končal s trikrat, petkrat in dvema razdelkoma, a je poskus dobro izvedel.

Opomba: Počasneje, več možnosti za invazijo RNaze.Kako se naučiti biti hiter?Ni možnosti, samo več vadite.

Za različne poskuse in različne vzorce je vseeno treba prebrati več literature in izbrati ustrezno metodo obdelave.Za postopek zbiranja in shranjevanja vzorcev MIQE zahteva, da mora biti jasno zapisano v prispevku, tako da lahko recenzenti preverijo zanesljivost prispevka, prav tako pa je priročno, da osupli mladi ponovijo vaš poskus.

Čeprav so biološki poskusi težki, so vrhunski.Če niste previdni, lahko prevrnete svet.Na primer spreminjanje SARS v biokemično krizo ali izdelava hibridnega riža za rešitev 1,3 milijarde ljudi.Spodnja slika je kemijski poskus, že ob pogledu na njegov kurac podoben videz bi morali razumeti, kako ponosni ste na svoje raziskave.Pozabi, ne črni ga.

MIQE (3) – ekstrakcija nukleinske kisline.
Ekstrakcija nukleinske kisline je velik dogodek in vsi poskusi molekularne biologije se začnejo z ekstrakcijo nukleinske kisline.Najprej kopirajmo vsebino MIQE o ekstrakciji nukleinske kisline.

Ob pogledu na ta obrazec ne moreš ostati na površju.Forma je dogma.Če želite biti najboljši študent, se morate vprašati, zakaj.Bistvena vsebina te tabele je: Zasledovatičistost, celovitost, konsistenca in ekstrakcijska količina RNA .

Prvi delPostopek ali instrument je korak ekstrakcije nukleinske kisline.Če za ekstrakcijo uporabljate avtomatski ekstraktor nukleinske kisline (napredno, za nakup me kontaktirajte), morate navesti ime modela instrumenta.

Ime kompleta in

kateri komplet je bil uporabljen za spremembe podrobnosti, kateri posebni reagenti so bili dodani ali kateri posebni postopki so bili opravljeni, je treba jasno razložiti, da lahko drugi zlahka ponovijo vaš poskus.

Nekateri dodajajo posebne reagente pri ekstrakciji posebnih vzorcev, saj mislijo, da je to njihovo skrivno orožje, in ne povedo drugim.Medtem ko ostanejo skrivnost, izgubijo tudi priložnost, da bi vaš članek zablestel.Ne bodi pameten, v znanstvenih raziskavah moraš biti poštenejši od podeželskega starega Zhanga, če hočeš biti pameten, te bo članek naredil neumnega.

mora zapomniti številko izdelka v kompletuko naročite komplet in napišete članek .Na kompletu sta običajno dve številki: Cat—kataloška številka (številka izdelka, številka artikla), Lot—številka serije izdelka (uporablja se za navedbo, iz katere serije je izdelek).

Poleg tega se številka CAS pogosto uporablja pri naročanju biokemičnih reagentov in jo bom skupaj populariziral.Številka CAS je številka, ki jo Ameriško kemijsko združenje podeli vsakemu novemu kemičnemu zdravilu.Na splošno so tri številke povezane s pomišljajem.Rushuijeva številka CAS: 7732-18-5.Kemikalije imajo pogosto več vzdevkov, vendar je številka CAS edinstvena.Pri naročanju zdravila lahko najprej preverite njegovo številko CAS.

Bližje domu, zakaj moramo te stvari jasno opisati?Pravzaprav gre tudi za preverjanje kakovosti ekstrakcije RNK.Z uporabo instrumentov in kompletov bo ekstrakcija RNK bolj dosledna.Obseg ekstrakcije v običajnih laboratorijih ni velik in ga je mogoče dobiti s kompleti.

Podrobnosti o zdravljenju z DNazo ali RNazo
Pomembno vprašanje fluorescentne kvantitativne PCR je preprečiti kontaminacijo DNA in ne eksperimentirati, če pride do kontaminacije.Zato je nujno, da navedete postopek, ki ste ga uporabili za obdelavo DNK, da dokažete, da je bila DNK v poskusnem procesu popolnoma in popolnoma odstranjena.predstavljen s shematskim diagramom.

Shematski diagram RNK in DNK
Na splošno je metoda za odstranjevanje DNA obdelava RNA z DNazo po ekstrakciji.Vendar so to relativno stare metode.Komercialni kompleti za ekstrakcijo RNK so lahko odstranili DNK med postopkom ekstrakcije brez dodajanja DNaze.Na primer, serija kompletov iz Foregene.

Opomba: Odstranjevanje DNK med ekstrakcijo RNK je zelo nevaren dvorezen meč, ki bo podaljšal čas delovanja ekstrakcije RNK in povečal tveganje za razgradnjo RNK.V bistvu gre za kompromis med donosom RNA in čistostjo.

Poleg tega je količina DNaze, dodane v adsorpcijsko kolono na osnovi silicijevega dioksida, zelo majhna, zato je treba za doseganje učinka uporabiti visokokakovostno DNazo.Neoptimizirane DNaze ni mogoče prebaviti hitro in v celoti.To je preizkus tehnične ravni trgovca.Seveda obstajajo še bolj čudni trgovci, ki se hvalijo, da je DNK mogoče odstraniti brez DNaze.Lahko rečemo, da je huligan vsak, ki se hvali, da je mogoče DNK popolnoma odstraniti brez DNaze.DNK je relativno stabilna dvoverižna struktura in je ni mogoče izbrisati samo z govorjenjem in smehom.

Ocena kontaminacije
metoda ocenjevanja: detekcija z elektroforezo, 1% agaroza, 6V/cm, 15min, nalaganje 1-3 ul

Kvantitativna analiza nukleinskih kislin
se običajno meri z UV spektrofotometrom.Naj najprej populariziram pomen treh vrednosti OD260, OD280 in OD230.
·OD260nm: To je absorpcijska valovna dolžina najvišjega absorpcijskega vrha nukleinske kisline, najboljša izmerjena vrednost pa je v območju od 0,1 do 1,0.Če ni, razredčite ali koncentrirajte vzorec, da bo v mejah.
·OD280nm: je absorpcijska valovna dolžina najvišjega absorpcijskega vrha beljakovin in fenolnih snovi.
·OD230nm: To je valovna dolžina absorpcije najvišjega absorpcijskega vrha ogljikovih hidratov.

Nato se pogovorimo o vlogi vsakega kazalnika.Za A260 se lahko uporablja za merjenje izkoristka nukleinske kisline.Ko je OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Za čistost moramo pogledati razmerja, ki jih običajno vidimo: OD260/280 in OD260/230.
·Čista DNK: OD260/280 je približno enak 1,8.Če je večji od 1,9, pomeni, da gre za onesnaženje z RNA, in če je manjši od 1,6, pomeni, da gre za onesnaženje z beljakovinami in fenoli.
· Čista RNA: 1,7
·OD260/230: Ne glede na to, ali gre za DNK ali RNK, je referenčna vrednost 2,5.Če je nižja od 2,0, pomeni, da gre za onesnaženje s sladkorjem, soljo in organskimi snovmi.

celovitost RNA

Zelo pomembno je izmeriti celovitost RNA.Na splošno je treba opraviti poskus denaturacije RNA v gelu, da preverimo, ali je svetlost med 28S in 18S RNA dvojna povezava.Ko se pojavi tretji pas 5S, pomeni, da se je RNK začela razgrajevati, razen pri nevretenčarjih.

Podatki za oceno kakovosti RNK: Poleg zgoraj navedenih testov obstajajo tudi nekateri bolj napredni instrumentalni testi glede celovitosti RNK, kot je RQI test integritete sistema za avtomatsko elektroforezo Experion, ki lahko zazna, ali se RNK nevidno razgradi.

V znanstvenih raziskavah je fluorescenčna kvantitativna PCR primerjava med ciljnim genom in notranjim referenčnim genom.Zato je v procesu ohranjanja vzorcev RNK, ekstrakcije RNK itd. primarni cilj zagotoviti celovitost RNK.

Kako celovitost RNA vpliva na ravnotežje med ciljnim genom in notranjim referenčnim genom, lahko zlahka razumemo iz spodnje slike.Razgradnja bo povzročila nepopolnost gena, ne glede na to, ali gre za nepopolnost notranjega referenčnega gena ali nepopolnost ciljnega gena, bo imela velik vpliv na podatke.

Shematski diagram ciljnega in referenčnega gena ne sme biti resničen

Preskus inhibicije (ali je vrednost CT potlačena pri visoki ali nizki koncentraciji ali drugih pogojih)

Če vzamemo to sliko kot primer, so vrednosti Ct petih krivulj naslednje.Porazdelitev vrednosti CT med krivuljami je neenakomerna, vrednosti Ct pa zamujajo pri visokih in nizkih koncentracijah, kar je v primeru inhibicije PCR.

Ključna točka: V procesu ekstrakcije RNK moramo opustiti napačne predstave in vzpostaviti pravilne.

Napačna ideja je: ekstrakcija RNA zasleduje le izkoristek, misleč, da večja kot je pridobljena količina RNA, tem bolje.Pravzaprav, ko izvajamo kvantifikacijo, če število genov ni zelo veliko, ne potrebujemo veliko RNA.Količina RNK, ki jo ekstrahirate, je več kot dovolj.

Pravilni koncept je:Ekstrakcija RNA mora slediti čistosti, celovitosti in doslednosti.Čistost lahko zagotovi, da kasnejša povratna transkripcija ni ovirana in DNK ne bo vplivala na podatke.Integriteta zagotavlja ravnovesje ciljnih sekvenc in notranjih referenc.Konsistenca zagotavlja stabilno nalaganje vzorca.

MIQE (4) – obratna transkripcija
Napačno prepričanje: prizadevanje za večji obseg vzorca.
Pravilni koncept: Prizadevajte si za doslednost (stabilnost), ne glede na količino naložene RNA, učinkovitost reverzne transkripcije ostaja dosledna, kar zagotavlja, da lahko razlike v cDNA resnično odražajo razlike v mRNA.
Ta postopek pojasnjujemo s shematskim diagramom:

Shematski diagram učinkovitosti reverzne transkripcije, ne drži
Najprej moramo razumeti razliko med postopkom reverzne transkripcije in postopkom PCR.PCR je podvržen več procesom segrevanja in žarjenja, ciljni fragment pa raste eksponentno;medtem ko reverzna transkripcija nima tega procesa, si lahko predstavljamo, da je reverzna transkripcija dejansko ena proti ena. Med postopkom replikacije je čim več kosov RNA

saj je mogoče dobiti čim več kosov informacij o cDNK, bi to morali že razumeti, ker so bili veliki in majhni fragmenti obratno prepisani in se je nemogoče osredotočiti na en fragment.In ker je količina RNA relativno majhna, je tudi količina pridobljene cDNA relativno majhna, za razliko od PCR, ki ima učinek pomnoževanja, zato ga je v bistvu nemogoče zaznati.

Rezultati elektroforeze cDNA
Drugič, v idealnem primeru se reverzna transkripcija izvaja ena proti ena, vendar nobena reverzna transkriptaza katerega koli podjetja ne more doseči tega učinka.V bistvu se učinkovitost večine reverznih transkriptaz giblje med 30-50%.Če je temu tako, bi raje imeli razmeroma stabilno učinkovitost reverzne transkripcije, kar želimo videti na sliki: 3 RNA dobijo 2 cDNA, 6 RNA dobi 4 cDNA, tako da ne glede na to, koliko vzorca je naloženega, je učinkovitost reverzne transkripcije relativno stabilna.Ne želimo videti situacije, ko je učinkovitost povratne transkripcije nestabilna in je visoka koncentracija zavrta.

Kako torej preveriti, ali je učinkovitost povratne transkripcije stabilna?Metoda je zelo preprosta, opraviti morate le primerjalni test: eden je, da po podvojitvi razredčitve RNA naredite povratno prepisovanje v cDNA, drugi pa je, da naredite podvojitev redčenja po povratnem prepisovanju v cDNA, nato pa naredite qPCR, da vidite dobljeni naklon, ali je skladen.Kot vrhunski študent bi to morali razumeti v nekaj sekundah.Kot je prikazano spodaj:

Redčenje RNA in cDNA za testiranje, ali je učinkovitost reverzne transkripcije stabilna
Reverzna transkriptaza in komplet
Kako ima lahko popolna fluorescenčna kvantitativna PCR odlično reverzno transkriptazo in komplet.Reverzno transkriptazo glede na izvor v grobem delimo na dve vrsti, AMV ozM-MLV, njihova učinkovitost pa je enaka tisti, ki je prikazana v tabeli.

Aktivnost RNaze H
RNaza H je ribonukleaza H, kitajsko ime je ribonukleaza H, ki je endoribonukleaza, ki lahko specifično hidrolizira RNA v hibridni verigi DNA-RNA.RNaza H ne more hidrolizirati fosfodiestrskih vezi v enoverižni ali dvoverižni DNA ali RNA, kar pomeni, da ne more prebaviti enoverižne ali dvoverižne DNA ali RNA.Običajno se uporablja pri sintezi druge verige cDNA.

To je čudna stvar.Pravimo, da ima reverzna transkriptaza aktivnost RNaze H, ne pa da reverzna transkriptaza vsebuje RNazo H in morda ne bo mogoče ločiti RNaze H od reverzne transkriptaze, morda zaradi konformacije določenih skupin v reverzni transkriptazi. To aktivnost povzroča reverzna transkriptaza.

Zato ne glede na večjo učinkovitost reverzne transkripcije AMV njegova aktivnost RNaze H zmanjša izkoristek cDNA.Seveda proizvajalci reagentov nenehno optimizirajo svoje izdelke, da čim bolj odpravijo aktivnost RNaze H v reverzni transkriptazi, da povečajo izkoristek cDNA.
Temperatura žarjenja

Sekundarna struktura RNA pri različnih temperaturah
Oglejte si zgornjo sliko za sekundarno strukturo RNA pri različnih temperaturah in uporabite spletno orodje mFold za določitev sekundarne strukture ciljnega fragmenta pri specifični temperaturi in pogojih koncentracije soli.Pri 55 °C je sekundarna struktura RNA še vedno zelo zapletena, reverzna transkriptaza ne more delovati in sekundarne strukture ni mogoče popolnoma razrešiti do 65 °C, medtem ko je optimalna temperatura AMV in M-MLV veliko nižja od te temperature.
kaj storiti?Sekundarna struktura je komplementarno združevanje same predloge, kar vodi do močne konkurence med osnovnim premazom in reverzno transkriptazo ter predlogo, kar ima za posledico vrsto težav, kot sta nizek E in slaba ponovljivost.

kaj storiti?Povečajte samo temperaturo žarjenja, kolikor je mogoče.

Mnogi proizvajalci reagentov izboljšujejo svojo reverzno transkriptazo z genskim inženiringom.Nekateri zvišajo temperaturo reakcije, kot sta Jifan in Aidelai, nekateri pa odstranijo aktivno skupino encima RNaze H, da izboljšajo afiniteto med encimom in predlogo RNA.Visoka afiniteta lahko konkurenčno iztisne sekundarno strukturo in jo gladko prebere ter močno izboljša učinkovitost povratne transkripcije.
Ključna točka: Reverzna transkripcija je pomembnejša za doseganje doslednosti učinkovitosti reverzne transkripcije (encimi ne smejo biti samo učinkoviti, ampak tudi stabilni), kot pa količina naloženega vzorca, če ne gre za posebno obsežno fluorescenčno kvantitativno PCR, sploh ne bo mogoče.Več cDNA.
Tudi različni proizvajalci so se nekoliko potrudili za doslednost.Na primer, večina podjetij je zdaj zapakirala obratno transkripcijo kot standardni komplet za prodajo, kar je dobra izbira.
Na primer kompleti serije RT Easy podjetja Foregene:

RT Easy I (glavni premiks za komplet za sintezo prve verige cDNA)

MIQE (5) – informacija o ciljnem genu

Zgornja slika pojasnjuje
1. Ali je ta gen učinkovit za ponavljajoče se poskuse, je na splošno mogoče preveriti s ponavljajočimi se poskusi.
2. Gene ID, saj veste.
3. Dolžina gena, skupna dolžina ciljnega gena zagotovo ni problem.Pri načrtovanju primerjev zagotovite, da je dolžina pomnožka med 80–200 bp, da zagotovite boljšo učinkovitost pomnoževanja.
4. Informacije o primerjavi zaporedja Blast, ciljni gen je treba primerjati v genski banki, da se prepreči nespecifično pomnoževanje.
5. Prisotnost psevdogenov.Psevdogen je zaporedje DNK, podobno normalnemu genu, vendar izgubi svojo normalno funkcijo.Pogosto obstaja v družini več genov evkariontov.Običajno ga predstavlja ψ.Gre za nefunkcionalno kopijo genomske DNK v genomu, ki je zelo podobna zaporedju kodirnega gena., se na splošno ne prepisujejo in nimajo jasnega fiziološkega pomena.
6. Položaj primerjev glede na eksone in introne.V prvih letih, ko smo reševali problem kontaminacije DNK, smo pogosto posvečali pozornost položajem primerjev, eksonov in intronov in na splošno razmišljali o oblikovanju primerjev čez introne, da bi se izognili pomnoževanju DNK.Prosimo, glejte spodnjo sliko: črna predstavlja introne, različne modre barve predstavljajo eksone, rožnata predstavlja običajne primerje in svetlo rdeča predstavlja primerje, ki zajemajo intron.

Shematično, nikoli res
Kako popoln načrt se zdi to, toda v resnici v večini primerov trans-intronski primerji niso tako čarobni, kot si predstavljajo, in bodo povzročili tudi nespecifično ojačanje.Najboljši način za preprečevanje kontaminacije DNK je torej popolna odstranitev DNK.
7. Napoved konformacije.S ponovno uporabo tega primera uporabite spletno orodje mFold za določitev sekundarne strukture ciljnega fragmenta pri določeni temperaturi in koncentraciji soli.

Sekundarna struktura RNA pri različnih temperaturah
Sekundarna struktura je komplementarno združevanje same predloge, kar bo vodilo do močne konkurence med primerjem in parom predloge, možnosti za vezavo primerja pa so manjše, kar ima za posledico vrsto težav, kot sta nizek E in slaba ponovljivost.S programsko napovedjo bi bilo to super, če ni problema s sekundarno strukturo.Če obstaja, bo naš nadaljnji članek posebej obravnaval, kako rešiti to težavo.

MIQE (6)—oligonukleotidi qPCR

Pri fluorescenčnem kvantitativnem PCR je prva stvar, s katero se vsak dan borite, ekstrakcija RNK, druga stvar pa je morda oblikovanje primerja.
Najprej še vedno preverimo pravila o oblikovanju temeljnih premazov v skladu s kontrolnim seznamom MIQE.Tako preprosta je, da se smejejo lahko bedaki, mi pa jo zaključimo z enim stavkom: ugotovite zaporedje in položaj sonde primerja ter način modifikacije.Za metodo čiščenja primerja je sinteza primerja trenutno tako poceni, qPCR je vreden PAGE in višjih metod čiščenja, informacije o instrumentu za sintezo pa niso pomembne.Mnogi ljudje delajo začetnike že desetletja in ne vedo, da je sintetizator ABI3900.
Kar zadeva načela oblikovanja bukvarjev, vam jih ni treba zapomniti na pamet, saj lahko večina programske opreme za oblikovanje bukvarjev ali spletnih orodij poskrbi za te težave (priporočeno spletno orodje primer3.ut.ee/), 99,999 % oblikovanja bukvarjev pa ni narejenih ročno. Poglejte, avtor včasih oblikuje na stotine začetnic na dan, če berete eno za drugo, bo postalo navzkriž.
Samo preverite naslednje točke, ko so primerji oblikovani:
1. Načrtujte primerje blizu 3' konca: V primeru uporabe oligo dT primerjev za sintezo prve verige cDNA je treba, ob upoštevanju učinkovitosti reverzne transkripcije in celovitosti RNA, oblikovane primerje oblikovati blizu 3' konca, da izboljšate učinkovitost pomnoževanja.Uporabite sliko, da razložite naslednje (tega ni mogoče razumeti):

Zakaj bi morali biti primerki oblikovani blizu konca 3', to ne sme biti res
2. Vrednost TM: Vrednost Tm je pri 55-65°C (ker je aktivnost eksonukleaze največja pri 60°C), vsebnost GC pa je pri 40%-60%.
3. BLAST: Da bi se izognili nespecifičnemu pomnoževanju genoma, je treba za dodatno preverjanje uporabiti Blast.

MIQE(7)—postopek qPCR

1. Komplet qPCR
V skladu z zahtevami MIQE moramo v članku jasno opisati celotne reakcijske pogoje, vključno s konfiguracijo reakcijskega sistema PCR, kateri komplet se uporablja, kdo je proizvajalec, kako velik je reakcijski sistem, ali se uporablja metoda barvanja ali metoda sonde, nastavitve programa PCR.Veterani vozniki bodo zagotovo ugotovili, da so zgornje informacije v bistvu določene, dokler je komplet izbran.
Trenutno je proizvodnja in proizvodnja fluorescentnih kvantitativnih PCR kompletov zelo zrela tehnologija.Dokler ne izberete izredno slabih proizvajalcev, verjetnost težav ni velika, vseeno pa želimo z vami deliti nekaj točk:
Encim Taq za vroč zagon:Najpomembnejši del PCR je encim Taq za vroč zagon.Encimi za vroč zagon na trgu so na splošno razdeljeni na dve vrsti, eden je kemično modificiran encim za vroč zagon (lahko si ga predstavljate kot parafinsko vgradnjo), drugi pa je encim za vroč zagon za modifikacijo protiteles (vezava antigen-protitelo).Kemična modifikacija je zgodnji način vročega zagona encimov.Ko je dosežena določena temperatura, bo encim sprostil svojo aktivnost.Encim vročega zagona, modificiran s protitelesi, uporablja biološke metode za blokiranje aktivnosti encima.Ko je dosežena določena temperatura, bo protitelo denaturirano in inaktivirano kot beljakovina, aktivnost encima pa bo vključena v igro.

Vendar, kakšna je uporaba tega?Tako je, aktivnost sproščanja s protitelesi modificiranih encimov je hitrejša kot pri kemično modificiranih encimih, zato so glede občutljivosti s protitelesi modificirani encimi v manjši prednosti, tako da kemično modificiranih encimov v kompletih na trgu praktično ni.Če obstaja, potem je tehnologija tega proizvajalca še vedno obtičala v dobi tisočletja.
Koncentracija magnezijevih ionov:Koncentracija magnezijevih ionov je zelo pomembna pri reakciji PCR.Ustrezna koncentracija magnezijevih ionov lahko spodbudi sproščanje aktivnosti encima Taq.Če je koncentracija prenizka, se aktivnost encima znatno zmanjša;če je koncentracija previsoka, se bo encimsko katalizirano nespecifično pomnoževanje povečalo.Koncentracija magnezijevih ionov bo vplivala tudi na žarjenje primerjev, temperaturo taljenja predloge in produktov PCR, kar bo vplivalo na izkoristek pomnoženih fragmentov.Koncentracija magnezijevih ionov je običajno nadzorovana pri 25 mM.Seveda mora biti za dober komplet koncentracija magnezijevih ionov dobro nadzorovana.Nekateri trgovci reagentu dodajo kelatno sredstvo za magnezijeve ione, s čimer lahko dosežejo učinek samodejne prilagoditve koncentracije magnezijevih ionov.
Koncentracija fluorescentnega barvila:Fluorescentno barvilo, ki je SYBR Green, ki ga običajno uporabljamo, v glavnem ustvarja fluorescenco z vezavo na manjši žleb dvoverižne DNK, ker je vezava barvila na dvoverižno DNK nespecifična, kar pomeni, da dokler je dvojnoverižna DNK kombinirana z njo, lahko pride do fluorescence, zato se bodo začetni dimeri in predloge DNK v sistemu združili z njo in tvorili signal v ozadju. .
PS: Zaradi svetlobno občutljivih lastnosti so izdelki na trgu običajno pakirani v rjave neprozorne centrifugalne epruvete (kot je prikazano na spodnji sliki).Vendar bo to naletelo na težavo.Pri vzorčenju je težko videti, ali je tekočina posesana.V tem pogledu je Qingke res najbolj uporabniku prijazen (kot je prikazano na spodnji sliki), prozorna tuba pa je pakirana v neprozorno pločevinasto vrečko.Nato ga dajte v pločevinasto vrečko, pri čemer upoštevajte priročnost izogibanja svetlobi in vzorčenju.Izbrati morate pravo številko izdelka.TSE204 je super stroškovno učinkovit obstoj, zaradi katerega želim saditi travo.

Zelo pomembna je tudi koncentracija fluorescenčnega barvila.Če je koncentracija prenizka, krivulja ojačanja v poznejši fazi ne bo šla navzgor in ni popolna;če je koncentracija previsoka, bo povzročila hrupne motnje.Ker je fluorescenčna kvantitativna PCR v glavnem odvisna od vrednosti CT, je nižja točka boljša od najvišje, če koncentracija fluorescenčnega barvila ni ustrezno prilagojena.Najboljša je seveda ustrezna koncentracija barvila.

ROX: Barvila ROX se uporabljajo za popravljanje napak fluorescenčnega signala od vdolbinic do vdolbinic.Nekateri proizvajalci instrumentov zahtevajo kalibracijo, drugi pa ne.Na primer, uporaba instrumenta Thermo Fisher Scientific za pomnoževanje v realnem času PCR običajno zahteva kalibracijo, vključno s 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus itd. To bo opisano v splošnih navodilih za komplet.
Foregene's qPCR Mix vsebuje tudi barvilo ROX, ki je priročno za uporabo v različnih modelih.

Real Time PCR Kit-Taqman

Obdelava šibke vodikove vezi: Obravnava šibkih vodikovih vezi je razmeroma tehnična zadeva.Nič ni prebral priročnikov številnih kompletov, vendar nobeden od njih ni omenil te teme.Pravzaprav je tako pomembno.Kombinacija baz je odvisna predvsem od moči vodikovih vezi.Močne vodikove vezi so normalno ojačanje, šibke vodikove vezi pa vodijo do nespecifičnega ojačanja.Če šibkih vodikovih vezi ni mogoče dobro odstraniti, se nespecifičnemu ojačanju ni mogoče izogniti.V okviru avtorja je le nekaj podjetij opazilo ta problem.Ko kupite komplet, se lahko obrnete na to, ali ste razmišljali o rešitvi v zvezi s tem za komplet, ki ga želite izbrati.

Reakcijski volumen: Sistem 20-50 ul se pogosteje uporablja in manjše količine bodo verjetno povzročile napake.Na splošno navodila za komplet priporočajo uporabo reakcijskih volumnov PCR.Ne bodite pametni in uporabite manjše količine, da prihranite stroške.cilj.Količina, ki jo priporočajo trgovci, je dejansko preizkušena in morda ne morejo rešiti problema napak, ki jih povzročajo majhne količine.
2. Proizvajalec in številka artikla cevne plošče
Vsi poznajo princip fluorescentne kvantitativne PCR.Zbiranje fluorescence se večinoma izvaja s pokrovčki za epruvete PCR.Pri izbiri potrošnega materiala za PCR bodite pozorni na dve točki: dobro prepustnost svetlobe in primernost za instrument.Na splošno so plošče in cevi običajnih znamk v redu, vendar morate skrbno izbrati glede prilagoditve, sicer instrumenta ne boste mogli uporabljati.

4. Vrhunsko znanje

MIQE (8)— validacija qPCR
To je glavna prednostna naloga qPCR!Toliko junakov je tukaj padlo v pesek.Seveda je možno tudi, da imate srečo in so geni, ki ste jih preučevali, preprosti, da ste skozi ledeno jamo lebdeli po vetru.Informacije o preverjanju qPCR so namenjene testiranju zanesljivosti podatkov.Potrebne podatke za preverjanje navajamo na naslednji način:

1. Test specifičnosti
Specifičnost pomnoževanja ciljnega gena se testira tako, da se preveri, ali je elektroforezna slika en pas;preverjanje zaporedja;krivulja taljenja, da vidite, ali je karta vrhov enojna;preverjanje encimske prebave in druge metode.
Pri tem se osredotočamo na tanaliza nespecifičnega pomnoževanja z metodo talilnih krivulj.Na splošno mora biti, ko načrtujemo primerje, velikost fragmenta produkta v območju 80–200 bp, zaradi česar je temperatura taljenja produkta PCR v območju 80–85 °C.Če torej obstajajo razni vrhovi, morajo obstajati drugi nespecifični produkti ojačanja;če se vrh pojavi pod 80 °C, se na splošno šteje za osnovni dimer;če se vrh pojavi nad 85 °C, se na splošno šteje za kontaminacijo DNK ali bolj nespecifično pomnoževanje velikih fragmentov.
Opomba: včasih je samo en vrh pri 80 °C.V tem času se je treba tega koncepta držati.Verjetno so vsi rezultati pomnoževanja začetni dimeri.

Normalna krivulja taljenja (en sam vrh brez nespecifičnega ojačanja)

Problematična krivulja taljenja (nespecifično ojačanje lažnih vrhov)
【Analiza primera】

Obstaja glavni vrh, vendar je osnovni dimer resen
Talilna krivulja z enim vrhom na spodnji sliki lahko zlahka zavede vaše oči, da mislite, da gre za popoln poskus, vendar je rezultat popolnoma napačen.V tem času moramo pogledati temperaturo taljenja.Najvišja temperatura je pod 80 °C, kar je popolnoma primerno.

Brez ciljnega fragmenta, vsi začetni dimeri
Tu se moj brat ne more ustaviti.Na spodnji sliki je slika, posneta z mobilnim telefonom, ki mi jo je poslal šopek.Reagenti, ki jih je uporabil, so blagovnih znamk, ki se običajno uporabljajo v industriji.Eno znamko s predpono T je zamenjal z drugo znamko s predpono T.Mislim, da ste že uganili.Beda mi je zajokala: »Reagent, uporabljen na prvi sliki, je predober, vrh pa je en sam.Kasneje, po uporabi reagenta, ki ste ga priporočili, postane kot na drugi sliki, z mešanimi vrhovi.Naredil si me nesrečnega.“
Ločite oba grafa.Na prvi pogled ima ena enojno konico, druga pa dvojno konico.Nesmisel, en vrh je seveda v redu.Je to res?
Hujši kot Dou E, če dam dve sliki na spodnjo sliko, vam bo takoj jasno.Pravzaprav nas takšna slika zlahka ohromi.Po natančni analizi smo ugotovili, da: je vrh prve številke pri 75 °C, kar je popolnoma osnovni dimer;vrh druge številke se pojavi pri 75 °C in 82 °C, vsaj tam je Izdelek se pojavi.

Slike povratnih informacij študentov
Temeljni problem torej ni problem reagentov, temveč problem oblikovanja primerja.Hkrati tudi dokazuje, da nekatere velike blagovne znamke niso kakovostne za železo, in dokazuje tudi, kar je prej rekel moj brat: Tvojega članka ne podpira znamka reagenta.Vaš članek je podprl znamko reagentov.Samo predstavljajte si, če bi smetek ne spremenil reagentov, bi bili v dnevnik poslani napačni podatki in to, kar bi se zgodilo, bi bila tragedija.
2. Ct vrednost slepe kontrole
Ne razlagajte, če ima slepa kontrola vrednost Ct, ali ni onesnaženje?Vendar pa morate še vedno razumeti, katera prazna kontrola ima vrednost Ct.Če je NTC, to pomeni, da obstaja tuja DNK, kot je kontaminacija z reagentom.Če gre za NRT, to pomeni, da ima ekstrahirana RNA kontaminacijo z DNA.
3. Standardna krivulja
Vključno z naklonom in formulo za izračun je mogoče učinkovitost PCR izračunati s formulo.Popoln poskus zahteva, da se naklon standardne krivulje približa 3,32, R² pa 0,9999.
4. Linearni dinamični razpon
Dinamični razpon reakcije je linearen.Glede na predlogo, uporabljeno za ustvarjanje standardne krivulje, mora dinamično območje vključevati vsaj 5 koncentracijskih gradientov in bodite pozorni na spremembo vrednosti Ct pri visokih in nizkih koncentracijskih gradientih.
5. Natančnost zaznavanja
Spremembe v rezultatih qPCR, torej slaba ponovljivost, torej slaba natančnost, so posledica številnih dejavnikov, vključno s temperaturo, koncentracijo in delovanjem.Natančnost qPCR na splošno postane manj nadzorovana, ko se število kopij zmanjša.Idealno znotraj eksperimentalne variacije bi se morala ta tehnična variacija razlikovati od biološke variacije, biološke ponovitve pa lahko neposredno obravnavajo statistične razlike v rezultatih qPCR med skupinami ali zdravljenji.Zlasti za diagnostične teste je treba poročati o najboljši medsebojni natančnosti (ponovljivosti) med lokacijami in izvajalci.
6. Učinkovitost zaznavanja in LOD (v multipleksni qPCR)
LOD je najnižja koncentracija 95 % odkritih pozitivnih vzorcev.Z drugimi besedami, koncentracija LOD v nizu ponovitev ciljnega gena ne sme preseči 5 % neuspelih reakcij.Pri izvajanju multipleksne analize qPCR, zlasti za hkratno odkrivanje točkovnih mutacij ali polimorfizmov, mora multipleksna qPCR zagotoviti dokaze, da natančnost več ciljnih fragmentov ni ogrožena v isti epruveti, učinkovitost večkratnega odkrivanja in odkrivanja ene epruvete in LOD morata biti enaka.Temu problemu je treba posvetiti pozornost, zlasti kadar se istočasno pomnožijo ciljni geni z visoko koncentracijo in ciljni geni z nizko koncentracijo.
Težave in rešitveNa splošno se težave, ki se pogosto pojavljajo pri odpravljanju napak qPCR, osredotočajo na naslednje vidike:
· nespecifična amplifikacija
·Težka izbira koncentracije primerjev in težave s primerji-dimeri
· Temperatura žarjenja je netočna
·Sekundarna struktura vpliva na učinkovitost ojačanja
nespecifična amplifikacija
nespecifična amplifikacija, se na splošno upošteva, ali zasnova temeljnih premazov ni primerna, če pa se vam ne mudi z menjavo temeljnih premazov, lahko najprej preizkusite naslednje metode (načelo je tudi priloženo):
·Povišajte temperaturo žarjenja – poskusite, da se šibke vodikove vezi ne morejo vzdrževati;
·Skrajšanje časa žarjenja in raztezanja – zmanjša možnost šibkih vodikovih vezi;
·Zmanjšajte koncentracijo primerjev – zmanjšajte možnost vezave odvečnih primerjev in netarčnih regij;
Nizka učinkovitost ojačanja
Situacija, ki je nasprotna nespecifičnemu ojačanju – nizka učinkovitost ojačanja, in ukrepi za obravnavo nizke učinkovitosti ojačanja so ravno nasprotni:
· Podaljšajte čas žarjenja in raztezka;
·Prehod na tristopenjsko PCR in znižanje temperature žarjenja;
· Povečajte koncentracijo primerja;
Ps: Mnogi podiplomski študenti, rojeni v 90-ih, nočejo študirati, kako razhroščevati poskuse, in upajo, da bo komplet lahko popolnoma rešil težavo (če želite po diplomi iti k podjetju za raziskave in razvoj reagentov). Pravzaprav tudi proizvajalci reagentov razmišljajo tako, upam, da je neumno Uporabite ga lahko, ko ga dobite, zato so proizvajalci reagenta vložili veliko truda, da bi rešili problem nespecifičnega ojačanja, vključno z uvedbo šibkega H-bona d absorpcijski faktorji.Za enostavno rešitev težave morajo bedaki še vedno prebrati uvod podjetja reagentov, da ugotovijo, ali obstaja faktor, ki absorbira šibke vodikove vezi.
Težavna izbira koncentracije primerjev in težave s primerji-dimeri
1. metoda: Na splošno so navodila za komplet za qPCR priporočene sisteme in priporočene koncentracije primerjev.
Metoda 2: Odpravljanje napak z nastavitvijo koncentracijskega gradienta primerja.Spodnja slika je ukradena podjetju za ponazoritev.Spodnja slika prikazuje kvantitativne rezultate fluorescence, narejene s tremi koncentracijskimi gradienti primerja (100 nM, 250 nM, 500 nM) in štirimi koncentracijskimi gradienti predloge (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Vrednost Ct eksperimentalnih rezultatov je prikazana na naslednji način:

Izbira koncentracije primerja Povežite vsako koncentracijo primerja v vrstico, kot sledi:

Izbira koncentracije primerja je očitna, linearno razmerje koncentracije primerja 100 nM in 250 nM je boljše, linearno razmerje koncentracije primerja 500 nM pa je relativno slabo.Pri 100 nM in 250 nM je vrednost Ct 250 nM razmeroma majhna, zato je optimalna koncentracija primerja 250 nM.Na talilni krivulji so na splošno vidni hudi primer-dimeri.Kaj pa, če se zasnovani primerji ne morejo izogniti primerjem-dimerjem?
3. metoda: Zmanjšajte količino temeljnih premazov in povečajte temperaturo žarjenja (razlaga ni potrebna).
Empirična vrednost temperature žarjenja je 60°C.Če niste prepričani, kako izbrati primernejšo temperaturo žarjenja?Odgovor je enak kot pri izbiri koncentracije primerja –gradientni test.Posnemite sliko podjetja Bio-rad, da ponazorite težavo.Za pomnoževanje določenega tarčnega fragmenta nastavite osem temperaturnih gradientov, vsakega s tremi ponovitvami, in dobljena pomnožitvena krivulja je naslednja:

Izbira temperature žarjenja:
·70°C, 69°C—v bistvu primerjev ni mogoče kombinirati, zato ni pomnoževanja.
·67,3°C – Na začetku je majhna količina ojačanja, vrednost Ct pa je relativno velika.
·64,5°C——Vrednost Ct se zmanjša.
·Pri 60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C in 55,0 °C so bile vrednosti Ct v bistvu stabilne, vendar so bile končne vrednosti fluorescence drugačne.
Kako izbrati?Načelo: Prvo načelo je višja vrednost Ct.Za enako vrednost Ct izberite višjo temperaturo žarjenja, da preprečite dimerizacijo in nespecifično ojačanje.Čeprav je vrednost fluorescence višja pri 55 °C, so lahko v njej dimeri ali nespecifično ojačanje.
Toda če ste tako pametni kot vi, boste zagotovo pomislili: logično gledano, če je reakcija PCR zelo specifična, dokler koncentracija primerja presega minimalne zahteve, visoke in nizke točke ne bi smele imeti učinka, tako kot fluorescenčna barvila in dNTP.Dokler je temperatura žarjenja pravilno optimizirana, bo učinek koncentracije temeljnega premaza na vrednost Ct seveda čim manjši.

Temperatura žarjenja je pravilno optimizirana in učinek koncentracije primerja na CT bo zmanjšan
Sekundarna struktura vpliva na učinkovitost ojačanja
Za ponazoritev težave vzemimo sliko iz Bio-rada.Oblikuje tudi temperaturni gradient za pomnoževanje gena s sekundarno strukturo.

Pojavi se sekundarna struktura
Vidimo lahko, da ko se temperaturni gradient zmanjša, se začnejo pojavljati produkti in vrednost Ct se pomika naprej, tako da doseže najnižjo vrednost pri 60,7 °C, nato pa, ko se temperaturni gradient zmanjša, postane vrednost Ct višja.Nasprotno, ko se temperatura poveča, se sekundarna struktura odpre in učinkovitost ojačanja se poveča.Ko je dosežena določena temperatura, zvišanje temperature ne more izboljšati učinkovitosti ojačanja.Ker temeljnih premazov trenutno ni mogoče stabilno kombinirati.zatopoiščite temperaturo z najnižjo vrednostjo Ct, ki je najboljša temperatura za ojačanje predloge sekundarne strukture!Pametni bedaki morajo seveda vedeti, da če ni nujno, je najbolje zamenjati primerje in se izogniti predelu sekundarne strukture.
5. Raven uporabe
MIQE—Analiza podatkov

Analiza podatkov je v glavnem podana s fluorescentnim kvantitativnim PCR instrumentom.V prejšnjem članku je bilo opravljenega veliko dela pri analizi podatkov, kot je slepa kontrola, ki je bila pojasnjena v načrtu poskusa.Notranji referenčni geni, ponavljajoča se števila itd. so bili pojasnjeni., tukaj pojasnjujemo predvsem uporabo qPCR.
qPCR se pogosto uporablja, eksperimentalno preverjanje in diagnoza nukleinske kisline pa sta najpogosteje uporabljena scenarija.
absolutna kvantifikacija
Log (začetna koncentracija) je linearno povezan s številom ciklov.Standardno krivuljo lahko narišemo iz standarda z znanim začetnim številom kopij, kar pomeni, da lahko dobimo linearno razmerje reakcije pomnoževanja.Glede na vrednost Ct vzorca lahko izračunamo koncentracijo v vzorcu.Količina predlog, ki jih je treba vključiti.

Absolutna kvantitativna metoda izračuna
Absolutna kvantifikacija mora temeljiti na standardni krivulji.Za izdelavo standardne krivulje je potreben standard.Običajno je standard plazmid, pridobljen s kloniranjem ciljnega gena.Zakaj je plazmid?Ker je krožna plazmidna DNK najbolj stabilna.Standardni izdelek razredčite v 5 do 6 gradientih glede na razmerje podvojitve (10-kratno redčenje) in pri redčenju bodite pozorni na enakomernost.Naj vrednost Ct pade med 15-30.

Standardna priprava
Hkrati je treba vzorec za testiranje tudi ustrezno razredčiti (zapomnite si faktor redčenja), vrednost Ct pa mora prav tako pasti med 15-30.Standardni izdelek in vzorec, ki ga je treba testirati, se skupaj postavijo na stroj.Po izvedbi je bila narejena standardna krivulja s standardno snovjo in vzorci za testiranje so bili preneseni v standardno krivuljo za izračun koncentracije.
Kvantifikacija virusa hepatitisa B HBV je tipična absolutna kvantifikacija, ki lahko izračuna število kopij virusa v 1 ml krvi.
Izračun števila kopij
Koncentracija vzorca za testiranje (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × faktor redčenja
Molekulska masa vzorca = število baz × 324
Število kopij vzorca za testiranje (kopije/ul) = koncentracija vzorca za testiranje / molekulska masa vzorca × 6 × 1014

Metoda izračuna števila kopij

Zgoraj je metoda izračuna za določitev količine.To je matematični problem, ki ga je mogoče rešiti po končani srednji šoli, matematične probleme pa praviloma rešujejo računalniki.Če ne razumete, lahko pridete komunicirat.
relativna kvantifikacija
Relativna kvantifikacija se uporablja predvsem v znanstvenih raziskavah.Koliko virusov je v 1 ml krvi in ​​gre za virus DNA, je to relativno determinističen dogodek: količino krvi je mogoče določiti in virus DNA je relativno stabilen.Vendar nam je težko primerjati število transkripcijskih kopij določenega gena v listu, ker je težko določiti velikost, težo in občutljivost lista, količino ekstrahirane RNA je težko določiti in učinkovitost reverzne transkripcije je prav tako težko določiti, kar pomeni, da lahko vsak korak povzroči napake v eksperimentalnih podatkih in jih ni mogoče uporabiti.
Zato mora relativna kvantifikacija uvesti element:notranji referenčni gen.
Z drugimi besedami, relativna kvantifikacija je pravzaprav primerjava med ciljnim genom in notranjim referenčnim genom.V primerjavi z istim tkivom in isto celico je vpliv velikosti vzorca, količine ekstrakcije RNA, učinkovitosti reverzne transkripcije in učinkovitosti PCR relativno majhen.Zaradi majhne velikosti vzorca so bili notranji referenčni geni in ciljni geni relativno zmanjšani.Zato smo že prej poudarjali enotnost in stabilnost.
Notranji referenčni geni so na splošnogospodinjski geni(house-keeping genes), ki se nanašajo na razred genov, ki so stabilno izraženi v vseh celicah, njihovi produkti pa so potrebni za vzdrževanje osnovnih življenjskih aktivnosti celic.
Ne zamenjujte tega pojma.Geni za gospodinjstvo so izrazi biološke funkcije, medtem ko so notranji referenčni geni eksperimentalni tehnični izrazi.Gospodinjski geni morajo prestati validacijo, preden jih lahko izberemo kot interne referenčne gene.
Na primer, na spodnji sliki smo izbrali več gospodinjskih genov, da bi testirali njihove ravni izražanja v različnih tkivnih celicah, in ugotovili, da so bili nivoji izražanja β-2-mikroglobulina precej drugačni od tistih drugih treh genov, zato jih ni bilo mogoče uporabiti kot notranje referenčne gene.

Po razumevanju korekcijske funkcije notranjega referenčnega gena sta zaradi uvedbe notranjega referenčnega gena izpeljana dva algoritma.
·metoda dvojne standardne krivulje
·2 – metoda △△Ct (metoda primerjave vrednosti CT)
Če vas zanima preučevanje vrst in funkcij genov, opustite raziskovanje algoritmov in neposredno uporabite formule ali neposredno uporabite stroje;če ste pošten človek v matematiki in tehniki, vas prosimo.
metoda dvojne standardne krivulje
Kvantificirajte ciljni gen in gen za gospodinjstvo kontrolnega vzorca in vzorca, ki ga želite testirati, s standardno krivuljo, nato pa izračunajte relativno vrednost v skladu s formulo za izračun, ki je relativna stopnja izražanja.
Prednosti: enostavna analiza, relativno enostavna eksperimentalna optimizacija
Slabost: Za vsak gen mora vsak krog poskusov narediti standardno krivuljo
Uporaba: Ena od dveh najpogosteje uporabljenih in priznanih relativnih kvantitativnih metod pri proučevanju regulacije izražanja genov
Formula je naslednja:

Primeri so naslednji:

Izračunajte relativno količino na podlagi kvantitativnega rezultata
2 – metoda △△Ct (metoda primerjave vrednosti CT)

Prednosti: Ni potrebe po izdelavi standardne krivulje
Slabosti: Predpostavlja se, da je učinkovitost ojačanja blizu 100 %;standardna deviacija je < 5 %, standardna krivulja in učinkovitost med vsakim ojačanjem pa se predpostavljata kot skladni;bolj zapletena je optimizacija eksperimentalnih pogojev.
Uporaba: Ena od dveh najpogosteje uporabljenih in priznanih relativnih kvantitativnih metod pri proučevanju regulacije izražanja genov

Seveda je običajno nemogoče, da bi bila učinkovitost pomnoževanja popolna 1. Metoda popravka: če vemo, da imata ciljni gen in referenčni gen enako učinkovitost pomnoževanja, vendar učinkovitost pomnoževanja ni enaka 1, potem lahko 2－△△Ct popravimo kot: (1+E )－△△Ct, na primer, če je učinkovitost pomnoževanja 0,95, potem lahko formulo za izračun popravimo na 1,9 5－△△Ct
Doslej se je končala vsebina o fluorescentni kvantitativni PCR.